1. Översiktlig projektbeskrivning

Engelsk titel

Genetical, immunological and environmental determinants of inflammatory disorders in the gastro-intestinal tract.

Sammanfattning av projektet

Bakgrund

1) Celiaki (CD) är en av de vanligaste kroniska sjukdomarna hos barn med en prevalens på minst 1% . Obehandlad sjukdom, även vid symtomfrihet, innebär ökad risk för autoimmun sjukdom, osteoporos, malignitet mm. Flera faktorer gör CD till en unik modell för andra komplexa sjukdomar. Den utlösande omgivningsfaktorn (gluten), de predisponerande HLA-molekylerna och det viktigaste autoantigenet (TG2) är kända och det drabbade organet (tarmen) är åtkomligt för studier.
En kombination av HLA-alleler kodar för en HLA-DQ2-molekyl som finns hos ca 95% av patienterna. Dessa är dock vanliga bland friska och bara en minoritet av bärarna utvecklar CD. Det genetiska bidraget från HLA DQ2 har beräknats till mindre än hälften.
För att motverka vanliga powerproblem vid genetiska studier av komplexa sjukdomar deltog vi i ett europeiskt forskningskonsortium med stöd av EU:s 5:e ramprogram. Genom poolad analys av 2 000 individer hittades bl a en starkt signifikant koppling till krom 5q31-33 som överensstämde med resultaten i vår egen genomscanstudie. Detta talar för att en sjukdomsgen finns i regionen.

2) Inflammatorisk tarmsjukdom (inflammatory bowel disease,IBD) är en kronisk skovvis förlöpande inflammation i tarmen och innefattar ulcerös kolit och Crohns sjukdom. Ca 20 % av patienterna insjuknar under barn- och ungdomsåren. Incidensen av pediatrisk IBD ökar i Sverige och länder med västerländsk livsstil. Inflammationen har potentiellt stor inverkan på livskvalitet, tillväxt och benmineralisering.
Genesen till sjukdomen är oklar och inkluderar teorier som autoimmunitet, infektioner eller ett dysregulerat immunsvar på tarmfloran.
Djurmodeller och kliniska studier indikerar att tarmfloran har etiologisk betydelse. . Mikrober och deras produkter interagerar med immunsystemet och kan därmed påverka olika processer som kan leda till antingen immunologisk tolerans eller inflammation. I denna interaktion kan barriärfunktioner i form av mukus och dess komposition också spela en viktig roll.
Mukus har en betydande roll i tarmens barriärskydd mot bakterier och dess komposition kan vara en etiologisk faktor vid kolit. MUC2 utgör huvudkomponenten i tjocktarmens mukuslager. I en musmodell har man funnit att avsaknad eller genetiska defekter i MUC2 leder till kolit, utlöst av tarmbakterier. Det finns sannolikt flera mutationer av MUC2-mucinet i befolkningen. Patienter med ulcerös kolit har lägre nivåer MUC2 både under aktiv sjukdom och remission, jämfört med kontroller.
Osteoporos drabbar 30% av vuxna med IBD. Tarminflammationen vid pediatrisk IBD skulle kunna hämma benmineraliseringen under en kritisk period pga det kroniska cytokinpåslaget.

3) Immunsuppression efter organtransplantation (tx) medför en ökad risk för opportunistiska virusinfektioner. Klinisk bild och histologiska fynd är ofta likartade vid virusinfektion och rejektion och tillstånden kan dessutom förekomma samtidigt. Vidare kan behandling av misstänkt rejektion med ökad immmunsuppression ge en virusinfektion fritt spelrum och omvänt kan behandlingen av många virusinfektioner med sänkning av immunsuppression öka risken för rejektion.
Virusmonitorering är därför viktig för såväl tidig identifiering av infektion som uppföljning av behandlingseffekt. Evidensbaserad kunskap om optimal monitorering saknas idag. Ett antal virus kan vara aktuella vid opportunistiska virusinfektioner efter transplantation.
CMV-infektion utvecklas hos 20-60% av barn efter transplantation och kan bl.a. orsaka feber, enterokolit, hepatit och bidra till rejektion. EB-virusinfektion (EBv) kan orsaka feber och leverpåverkan, men också PTLD, ett potentiellt malignt lymfoproliferativt tillstånd . Adenovirus (ADv) och BK-virus (BKv) kan hos immunsupprimerade orsaka livshotande komplikationer. Humant herpesvirus-6 (HHv-6) kan reaktiveras men den kliniska betydelsen är ofullständigt känd
Transplantation av tunntarm,har de senaste 10 åren utvecklats till en etablerad behandling vid irreversibel tarmsvikt med 1-årsöverlevnad för graft och patient på drygt 70%. Risken för rejektion är mera uttalad än efter t ex levertx och förekommer hos 70-90% av patienterna. Tillförlitliga serummarkörer för diagnostik saknas. Istället görs endoskopisk övervakning med histologi. Detta är resurskrävande och ej riskfritt och den histologiska bilden är ofta svårtolkad. Detta pekar på behovet av screeningtest för rejektion. Calprotectin, som mäts i feces och finns i bl a neutrofila och tarmepitelceller, har rapporterats som en potentiell rejektionsmarkör. Andra potentiella markörer vars betydelse ännu inte utvärderats är ECP, lactoferrin och MPO.
Koncentrationsbestämningar av läkemedlen används för att styra immunsuppressionen men är otillräckligt då individuella faktorer spelar stor roll. Immuknow Cylex® är ett nytt test för bedömning av immunsuppressionen genom skattning av T-cellsreaktivitet. Den kliniska användbarheten har hittills bara studerats i begränsad omfattning. Analys av genetisk expression i tarmbiopsier via kvantifiering av mRNA kan vara ett alternativt sätt att karakterisera inflammationskaskaden för differentialdiagnostik mellan infektion och rejektion.
Orofacial granulomatos (OFG) är en klinisk entitet med karakteristiska kroniska inflammationsförändringar i munhålan. I en ny studie på barn har vi visat att OFG kan indikera olika former av systemsjukdom, såväl Crohns sjukdom som födoämnesallergi. Vi har hos barn som genomgått organtx nyligen identifierat en OFG-liknande sjukdomsbild med granulom i munslemhinnan, svullna läppar, munvinkelragader samt tungfissurer. Denna kliniska bild har inte tidigare rapporterats.

4) Allergi är ett stort hälsoproblem och födoämnesallergi är ofta den första manifestationen vid allergiutveckling. Mikrober och deras produkter interagerar med immunsystemet och kan därmed påverka olika processer som kan leda till antingen immunologisk tolerans mot födoämnesprotein eller allergisk inflammation. Tarmkolonisationen under första levnadsåret kan här vara av särskild betydelse.

Syfte

Det övergripande målet är att studera bakomliggande sjukdomsmekanismer vid inflammationstillstånd i mag-tarmkanalen. Detaljerade syften enligt följande:

Att undersöka:
1) Celiaki:
a) sjukdomsrelaterade haplotyper och funktionella polymorfier
b) genexpression och –funktion
c) genotyp-fenotyp-korrelation
d) isolerade lymfocytpopulationer från DQ2-negativa CD-patienter för att bättre förstå de immunologiska mekanismerna vid CD

2) IBD:
a) tarminflammation i relation till tarmflorans sammansättning och genuttryck
b) betydelse av mukusbarriärens komposition och genetiska defekter vid pediatrisk IBD
c) tarminflammationens inverkan på benmineraliseringen

3) Organtransplantation och immunsuppression:
a) viruskoncentrationer i blodet för att identifiera behandlingskrävande infektioner och övervaka behandlingseffekt
b) metoder för att bättre särskilja infektion och rejektion: immunprofil och specifik mRNA-kvantifiering
c) OFG-liknande tillstånd efter tx med oklar genes

4) Födoämnesallergi: Tarmflorans betydelse för allergiutveckling/immunologisk tolerans.

Metod och material

1 Celiaki
a) Insamlade material från Sverige och Norge med 107 familjer med minst två sjuka barn resp 220 familjer med ett sjukt barn undersöks nu på krom 5q31-33. Gener i sjukdomsrelaterade haplotyper sekvenseras och testas funktionellt med analyser på mRNA- och proteinnivå. Expressionsnivåer av olika kandidatgenvarianter kommer att analyseras.
Resultaten verifieras i oberoende material inom ramen för vårt internationella forskningssamarbete. Även andra kandidatregioner kommer att undersökas på motsvarande sätt.
b) Expression av mRNA från CD-associerade gener i regionen 5q32 undersöks i tarmbiopsier från barn med CD under aktiv sjukdom och i remission och kontroller för att undersöka betydelsen för sjukdomsutveckling.
c) Genetiska fynd korreleras mot vårt material av kliniskt välkontrollerade data för studier av förhållandet mellan genotyp, omgivningsfaktorer och fenotyp.
d) Mindre än 5% av pat med CD saknar HLA DQ2. I vårt material finns några patienter som tillhör denna grupp. Vi planerar att ta tarmbiopsier för att isolera lymfocyter och undersöka om deras reaktivitet mot gluten avviker från DQ2-positiva CD-patienter.

2)IBD
a) I pågående studier har hittills 75 barn med misstänkt IBD inkluderats. Studien har i år utökats för att följa barn longitudinellt under såväl remission som skov med kartläggning av tarmflorans sammansättning och interaktioner med individens immunsystem. Barn med säker IBD-diagnos jämförs med barn som vid utredning saknar påvisbar inflammation i tarmen samt med friska barn utan symtom.
Tarmfloran analyseras med särskilt utvecklad teknik inkl odling, T-RFLP och analys av kemisk sammansättning av tarmfloran med GC-MSMS.
Analys av immunologiskt status görs med flödescytometri för kvantifiering av B-celler, T-celler och NK-celler. Vidare analyseras cellerna avseende aktiveringsgrad och minnesfenotyp. Regulatoriska T-celler kvantifieras. Cytokinmönster analyseras med ELISA. Reaktiviteten relateras till mutationer i NOD2 och andra relevanta receptorer för mikrobiella komponenter analyseras i samarbete med Leonid Padyokov, Inst för Molekylärmed, Karolinska inst.
Analys av inflammationsmarkörer i feces innefattar calprotectin, lactoferrin, MPO och ECP.
b) Tarmmukus sammansättning undersöks kemiskt och genetiskt vid pediatrisk IBD för mutationer av gener som kodar muciner, i första hand MUC2. Tjugofem barn med ulcerös kolit och med släkthistoria avseende IBD inkluderas. Tarmmukus undersöks kemiskt på tarmbiopsier och genetisk sekvensering görs på blod.
c) En longitudinell populationsbaserad studie görs av 146 barn med IBD som undersökts med DEXA och analyser av inflammations- och benmarkörer. Studien utvidgas nu med IBD-ungdomar som uppnått sin maximala bentäthet; förutom DEXA undersöks de med ny högupplösande CT-teknik som ger detaljinformation om benkvalitet.

3)Organtransplantation och immunsuppression
a) Barn som genomgått lever- eller tarmtx efter januari 2006 ingår i en prospektiv studie. Kliniska data registreras. Virus analyseras i blod, urin och saliv. Prover monitoreras enligt protokoll och vid klinisk misstanke om infektion. Vid tarmtx analyseras även biopsier från tarm och resultatet relateras till mängden humana celler genom analys av human gen (betaglobin). Virus-DNA analyseras med s.k. Taqman-teknik i realtids-PCR. Samband mellan virusnivå och kliniska symtom studeras i syfte att finna tröskelvärden för behandlingsbehov eller risk för komplikationer.
b) Analys av calprotectin, MPO, ECP och lactoferrin i feces utföres. Samtidigt utförs endoskopi med tarmbiopsi, vilket även görs vid misstänkt rejektion. Biopsierna analyseras för uttryck av gener som aktiveras vid inflammation och apoptos, såsom perforin, granzyme B, FasL, calprotectin. Genexpression bedöms genom kvantifiering av mRNA med realtids-PCR. CD4+ T-cellsfunktionen som ett mått på netto-immunsvaret, analyseras på helblod med Cylex Immuknow®.
c) Strukturerad klinisk uppföljning av tx-patienter med OFG i samarbete med Kliniken för Oral Medicin för kartläggning av potentiella etiologiska faktorer och uppföljning av naturalförlopp. Biopsier tas för histologisk karakterisering inkl immunhistokemi och blodprov tas för immunstatus inkl cytokinprofil, autoantikroppar och allergimarkörer.

4)Födoämnesallergi
Klinisk utvärdering vid allergiska symtom och vid 18 och 36 mån ålder. Odlingar från näsa och tarm samt blodprov som analyseras avseende aktivering och mognad av lymfocyter.

Arbetsplan och preliminära resultat

1)Celiaki
a) Arbetet fortsätter efter två linjer:• Studier av kandidatområden i vårt tidigare insamlade material med 107 familjer med; två sjuka barn och 250 familjer med ett sjukt barn och föräldrar. Vi har analyserat 1536 SNPer i den starkt kopplade regionen på 5q31-33. I 7 subregioner fann vi association till specifika haplotyper. Dessa har analyserats och resultaten utvärderas nu och konfirmeras i 250 oberoende CD-familjer. Vid fynd av sjukdomsorsakande delregioner går vi vidare med analys av genetisk variation och därefter sekvensering.• Replikationsstudier av egna och andras fynd i meta-analyser i samarbete med internationella forskargrupper. Dessa studier är väsentliga då stora material är nödvändiga för tillräcklig statistisk power. Vi har ett väl etablerat samarbete med forskargrupper i flera länder som nu utvidgas ytterligare. Nyligen har vi konfirmerat en haplotyp som sträcker sig över IL2 och IL21 som första riktigt trovärdiga riskorsakande genregion vid CD utöver HLA. Vi kommer att gå vidare med sekvensering och funktionell analys.
b) Studier av mRNA-expression i tarmbiopsier med realtids-PCR som mäter mängden mRNA och därmed genexpressionen. Individer med aktiv CD jämförs med individer i remission. Vid Genomics core facility i Göteborg görs detta med TaqMan-teknologi av antingen enstaka kandidatgener eller upp till ett par hundra gener åt gången med T-LDA-kort.
c) Ett stort arbete är nedlagt för att dokumentera klinisk bild och säkerställa korrekt CD-diagnos för patienterna i vårt material. Det innebär att materialet ger goda möjligheter till genotyp-fenotypstudier där genetiska fynd korreleras till kliniska data.
d)Isolering av lymfocyter från tarmbiopsier på DQ2-negativa CD-patienter görs med etablerad teknik [18]. Detta sker i Oslo i samarbete med Sollid - Lundins grupp.

2)IBD
a) Klinisk bild kartläggs med anamnes, laboratorieprover och endoskopi och sjukdomsförloppet följs över tid. Resultat relateras till tarmflora, individens immunologiska status samt genmarkörer.
Studien omfattar nu 75 patienter, varav 40 patienter med IBD. Rekrytering beräknas pågå till våren 2008 och patienterna kommer att följas för analys av tarmflorans sammansättning och immunologiskt status under remission och sjukdomsskov.
Preliminära resultat indikerar en dysbalans i tarmfloran med en relativ brist på G+ anaerober hos barn med ulcerös kolit och en relativ ökning av G- bakterier både vid ulcerös kolit och Crohns sjukdom.
b) 25 barn med ulcerös kolit och släkthistoria för IBD inkluderas. Kompositionen av tarmmukus på tarmbiopsier undersöks och genetisk analys utförs vid ”Genetic core facility” i Göteborg. Vid påvisande av mutationer kommer dessa att relateras till klinisk bild, tarmflorans sammansättning och immunologiskt status. Studien planeras i samarbete med prof. Gunnar Hansson.
c) Barn/ungdomar med IBD (146 patienter,6-19 år) följs vartannat år i en longitudinell populationsbaserad studie av tarminflammationens inverkan på bentäthet och har undersökts vid två tillfällen. Även föräldrarna har undersökts med DEXA för att utvärdera ärftlighetens betydelse. En tredje undersökningsomgång planeras de närmaste 2 åren och utvidgas då till att omfatta undersökning med högupplösande CT för detaljerad bedömning av benkvalitet.
Resultat från det första uppföljningen visar att hela 47% av barn med IBD har låg bentäthet (Z-score < -1SD) medan ca 25% har svår osteopeni (Z-score < -2SD).

3) Organtransplantation och immunsuppression
a) Vid studier av opportunistiska virusinfektioner hos barn efter organ- och stamcellstx 1995-2004 fann vi att CMV DNA i serum verkade vara en tidig och användbar indikator på CMV-infektion där kvantitativ analys verkade skilja ut patienter med symtomatisk infektion [22] och att EBV-DNA-kvantifiering i serum användbart för att skilja aktiv symtomatisk från asymtomatisk/latent infektion och för att monitorera patienterna [23]. Denna del är i sin slutfas.
Datainsamling och analys i en prospektiv studie av opportunistiska virusinfektioner hos barn efter organ- och stamcellstx 2006-2009 pågår.
b) Studier av inflammatoriska förändringar vid infektion respektive rejektion med markörer i tarmeluat och biopsier. Prospektiva studier av barn och vuxna efter tarmtx kommer att starta inom kort.
c) Identifiering av ett OFG-liknande tillstånd har skett i samarbete med professor Mats Jontells grupp, Kliniken för Oral Medicin, Sahlgrenska Akademin. Förloppet hos dessa patienter kommer att följas med biopsier från munhålan, endoskopi och immunologiskt status.

4)Födoämnesallergi
Vi har tidigare deltagit i Immunoflora-studien som visade att barn som under de första levnadsdagarna koloniserades i tarmen med en superantigen-producerande stam av S. aureus, uppvisar expansion av regulatoriska T-celler, samtidigt som dessa barn tenderade att ej utveckla födoämnesallergi. Vi undersöker nu om tidig kolonisation av superantigen-producerande S. aureus kan skydda mot allergiutveckling.
Studien, som görs tillsammans med doc Agnes Wolds grupp, startade 2005 och hittills har 49 barn rekryterats, varav 30 är koloniserade med S. aureus i näsa eller tarm. Patienterna följs kliniskt och med odlings- och blodprov vid uppseglande allergiska symtom och vid 18 och 36 mån ålder.

Typ av projekt

Forskningsprojekt

MeSH-termer för att beskriva ämnesområdet

Inlagda MeSH-termer

Gastrointestinal Tract

Generally refers to the digestive structures stretching from the MOUTH to ANUS, but does not include the accessory glandular organs (LIVER; BILIARY TRACT; PANCREAS).

Gastrointestinal Diseases

Diseases in any segment of the GASTROINTESTINAL TRACT from ESOPHAGUS to RECTUM.

Irritable Bowel Syndrome

A disorder with chronic or recurrent colonic symptoms without a clearcut etiology. This condition is characterized by chronic or recurrent ABDOMINAL PAIN, bloating, MUCUS in FECES, and an erratic disturbance of DEFECATION.

Intestinal Diseases

Pathological processes in any segment of the INTESTINE from DUODENUM to RECTUM.

Digestive System Diseases

Diseases in any part of the GASTROINTESTINAL TRACT or the accessory organs (LIVER; BILIARY TRACT; PANCREAS).

Academic Dissertations

Works consisting of formal presentations made usually to fulfill requirements for an academic degree.

Child

A person 6 to 12 years of age. An individual 2 to 5 years old is CHILD, PRESCHOOL.

Population

The total number of individuals inhabiting a particular region or area.

Projektets delaktighet i utbildning

Avhandling
D-uppsats / Magisterexamen
C-uppsats / Kandidatexamen
ST-läkarutbildning
Annan utbildning
Ej del i utbildning

3. Processen och projektets redovisning

Pågående aktiviteter

Planering och förberedelse före datainsamling
Datainsamling pågår
Analys av insamlade data pågår
Författande av skriftlig redovisning / publikation pågår
En eller flera publikationer från projektet är publicerade
Slutfört och inget mer görs inom ramen för detta projekt

Projektstart (när planeringen påbörjas och börjar dokumenteras skriftligt)

2007-01-01

Datum för påbörjande av datainsamling

2007-01-01

Datum då projektet är slutrapporterat

2011-12-01