1. Översiktlig projektbeskrivning

Engelsk titel

ANTIBIOTIC RESISTANCE IN CLINICALLY-RELEVANT BACTERIA: TIME- AND COST-EFFECTIVE DIAGNOSTIC IDENTIFICATION AND TYPING BY MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY

Sammanfattning av projektet

Den ökande förekomsten av resistens (AB-R) bland bakterier som normalt är känsliga för antibiotika-behandling är väl dokumenterad. Ökningen beror till stor del på för hög användning av antibiotika och bristande vårdhygien. Genom överföring av gener mellan olika arter sprids resistensanlagen och nya multiresistenta bakterier kan uppstå.
Extended spektrum beta-laktamas (ESBL)- bakterier producerar enzymer som hydrolyserar och effektivt inaktiverar antibiotika av beta-lactam typ, t ex penicillin och cephalosporiner. I Västra Götalands regionen, liksom i övriga Sverige och världen, har förekomsten av ESBL-producerande bakterier ökat lavinartat de senaste åren.
För epidemiologisk kartläggning av AB-R-bakterier krävs dels typning av bakteriestammen, dels typning av resistensfaktorerna, eftersom dessa överförs mellan bakterier.

Målet med detta projekt är att med hjälp av masspektrometri (MS) som diagnostiskt verktyg snabbare kunna identifiera och karakterisera AB-R-bakterier och resistensfaktorer, med fokus på ESBL-producerande bakterier. Dels isolerade bakterier, men även direkt i kliniska prov.

Kliniska prover och bakterieisolat kommer att samlas in på Bakteriologiska laboratoriet vid Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Laboratoriemedicin i Borås och på Klinisk Mikrobiologi, Uddevalla sjukhus.
Identifierings och typnings metoder kommer att etableras med hjälp av högupplösande MS analys och korreleras till traditionell utprövning av antibiotika resistens samt DNA-baserade PCR och sekvenserings metoder. Masspektrometri (MS) är ett relativt nytt diagnostiskt redskap för identifiering av mikroorganismer; Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) MS kan användas på intakta cellproteiner och Liquid-Chromatography Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (LC FT-ICR) MS på peptider från nedbrutna proteiner.
Vi samarbetar med företaget, AnagnosTec GmbH, i Potsdam, Tyskland för analys av MALDI-TOF data, med hjälp av deras mjukvara för identifiering av bakterier “SARAMIS™”
Utveckling av LC FT-ICR MS för stamtypning och ESBL-typning kommer att göras i samarbete med Proteomics Core Facility vid Sahlgrenska akademin

I de flesta tidigare försök att etablera effektiva diagnostiska metoder för AB-R har isolering av den infekterande bakterien krävts och därefter en fortsatt prövning av AB-R. Identifiering och typning av bakterier och AB-R-faktorer med MS skulle innebära avsevärda förbättringar vad gäller snabbhet och kostnad. Direkt detektion från kliniska prov skulle innebära att korrekt behandling av patienten kan sättas in snabbare.
Med denna metod erhålls en högupplösande, reproducerbar differentiering av bakteriestammar, vilket krävs för att kunna följa ett utbrott av antibiotika resistenta stammar och spridning av resistens-faktorer
Dessa metoder etableras med det slutgiltiga målet att de ska kunna användas på ett bakteriologisk rutin-laboratorium och därmed förbättra kontrollen av AB-R-bakterier inom vården och i samhället.

Typ av projekt

Forskningsprojekt

MeSH-termer för att beskriva ämnesområdet

Inlagda MeSH-termer

Drug Resistance

Diminished or failed response of an organism, disease or tissue to the intended effectiveness of a chemical or drug. It should be differentiated from DRUG TOLERANCE which is the progressive diminution of the susceptibility of a human or animal to the effects of a drug, as a result of continued administration.

Drug Resistance, Bacterial

The ability of bacteria to resist or to become tolerant to chemotherapeutic agents, antimicrobial agents, or antibiotics. This resistance may be acquired through gene mutation or foreign DNA in transmissible plasmids (R FACTORS).

Drug Resistance, Microbial

The ability of microorganisms, especially bacteria, to resist or to become tolerant to chemotherapeutic agents, antimicrobial agents, or antibiotics. This resistance may be acquired through gene mutation or foreign DNA in transmissible plasmids (R FACTORS).

Drug Resistance, Multiple, Bacterial

The ability of bacteria to resist or to become tolerant to several structurally and functionally distinct drugs simultaneously. This resistance may be acquired through gene mutation or foreign DNA in transmissible plasmids (R FACTORS).

Drug Resistance, Multiple

Simultaneous resistance to several structurally and functionally distinct drugs.

Projektets delaktighet i utbildning

Ej del i utbildning

2. Projektorganisation och finansiering

Organisationskod för var projektorganisationen finns

SWE:O-L-VGR:GB-SV-SU-O4

3. Processen och projektets redovisning

Pågående aktiviteter

Planering och förberedelse före datainsamling
Datainsamling pågår
Analys av insamlade data pågår
Författande av skriftlig redovisning / publikation pågår
En eller flera publikationer från projektet är publicerade
Slutfört och inget mer görs inom ramen för detta projekt

Projektstart (när planeringen påbörjas och börjar dokumenteras skriftligt)

2009-01-01

Datum för påbörjande av datainsamling

2009-02-01

4. Detaljerad projektbeskrivning

Bakgrundsbeskrivning

Den ökande förekomsten av antibiotika resistens (AB-R) bland bakterier som normalt är känsliga för antibiotika är väl dokumenterad och beror till stor del på för hög användning av antibiotika och bristande vårdhygien. AB-R utgör ett hot mot den kontroll vi idag har av infektionssjukdomar (5,9). Extended spektrum beta-laktamas (ESBL)-producerande bakterier uttrycker enzymer som hydrolyserar och effektivt inaktiverar antibiotika av beta-laktam typ, t ex penicillin och cephalosporiner (21,22). Sedan det första ESBL (11) identifierades i en bakterie har mer än 400 varianter karakteriserats (10). I Västra Götalands regionen, liksom i övriga Sverige, har förekomsten av ESBL-producerande bakterier ökat de senaste åren. Genom överföring av gener mellan olika arter sprids resistensanlagen och nya och multiresistenta bakterier uppstår (2). ESBL är idag vanligast förekommande i Escherichia coli och andra Enterobacteraceae.
För en effektiv kontroll av AB-R behövs förbättringar inom diagnostik av AB-R-bakterier samt inom detektion och typning av relevanta resistenssfaktorer. Masspektrometri (MS) är ett relativt nytt diagnostiskt redskap för identifiering av mikroorganismer; Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) MS kan användas på intakta cellproteiner (7) och Liquid-Chromatography Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (LC FT-ICR) MS på peptider. Dessa metoder möjliggör identifiering och typning av bakterier genom detektion av karakteristiska biomarkörer.
I de flesta tidigare försök att etablera effektiva diagnostiska metoder för AB-R har isolering av den infekterande bakterien krävts och därefter en fortsatt prövning av ABR; totalt 48-72 timmar innan resultat. Direkt detektion från kliniska prov skulle innebära att korrekt behandling av patienten kan sättas in snabbare. Identifiering och typning av bakterier och AB-R-faktorer med MS skulle också innebära avsevärda förbättringar vad gäller snabbhet och kostnad jämfört med nuvarande metoder.

Syfte

Vi har satt upp fyra mål för att utveckla och optimera användningen av masspektrometri (MS) som diagnostiskt verktyg för identifiering, typning och kontroll av antibiotika-resistens (AB-R) i kliniska miljöer

A. Identifiering av AB-R-bakterier, med fokus på ESBL-producerande bakterier,
Utveckling och optimering av metod och databaser för MALDI-TOF MS identifiering av ABR-bakterier, med fokus på ESBL-producerande bakterier som isolerats från kliniska prov. Data kommer att jämföras med klinisk och epidemiologisk data samt korreleras till traditionell antibiotikaresistens bestämning och DNA-baserade PCR och sekvensering metoder. Med MALDI-TOF MS studeras bakteriella proteiner i området 3000-20000 kDa (1). De bakteriella ribosomala proteinerna inom detta spektrum ger en karakteristisk profil och möjliggör identifiering av bakterier på artnivå (20)

B. Typning av ESBL-producerande bakteriestammar.
Utveckling och optimering av metod och databaser för MALDI-TOF och tandem LC FT-ICR MS för typning av ESBL-producerande bakteriestammar. För stamtypning måste andra proteiner än de ribosomala proteinerna kartläggas. Eftersom de ribosomala proteinerna utgör upp till 70 % av cellens totala proteinmängd kommer de exkluderas och proteiner större än 20 000 kDa att analyseras (24). Data kommer att korreleras till traditionell antibiotikaresistens bestämning samt till typnings resultat av DNA-baserade metoder. Stamtypning är särskilt viktig för kartläggning av utbrott, liknande det i Uppsala 2005 (12).

C. Typning av resistensfaktorer i ESBL-producerande bakteriestammar
Utveckling och optimering av metod och databaser för MALDI-TOF och tandem LC FT-ICR MS typning av resistensfaktorer i ESBL-producerande bakteriestammar. Beta-laktamas enzymerna är större än de ribosomala proteinerna och således kommer proteiner större än 20 000 kDa att analyseras. Med denna typningsmetod kan både kvalitativ och kvantitativ analys av ESBL-typ(er) i en ESBL-producerande bakterie göras (4).

D. Typning av ESBL-bakterier direkt från kliniska prov
Utveckling och optimering av snabb (mindre än 8 timmar) och kostnadseffektiv (mindre än 400 SEK) identifiering och typning av ESBL-bakterier direkt från kliniska prov med MALDI-TOF och tandem LS-ESI MS. En metod baserad på magnetiska kulor (19) för separation och koncentration av bakterier ur kliniska prov (urinprov och blododlingar) kommer att utvecklas för detta ändamål.

Metod: Databearbetning

Detta projekt är ett samarbete mellan Bakteriologiska laboratoriet, Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Enheten för Laboratoriemedicin och vårdhygien in Borås och Klinisk Mikrobiologi, Uddevalla Sjukhus. Vi samarbetar också med företaget, AnagnosTec GmbH, i Potsdam, Tyskland för analys av MALDI-TOF data, med hjälp av deras mjukvara för identifiering av bakterier “SARAMIS™” (http://www.anagnostec.eu/products-services/saramis.html). Utveckling av LC FT-ICR MS för stamtypning av ESBL-producerande bakterier och ESBL-typning kommer att göras i samarbete med Proteomics Core Facility vid Sahlgrenska akademin (http://www.cf.gu.se/Proteomics/).
Detta projekt kommer att samordnas med ett pågående ALF-LUA projekt med fokus på analys av ESBL-producerande bakterier (pågår 2008-2010).
Preliminära resultat inkluderar en utvecklad MLSA metod för identifiering och typning av Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter och andra genus. MLVA metoden för stamtypning av E. coli, samt andra bakterier finns redan och kommer att sättas upp och anpassas för analys av ESBL-producerande bakterier i detta projekt. I ALF-LUA projektet har även en multiplex PCR metod för typning av ESBL-gener satts upp.
Resultatet av ESBL-typning kommer att jämföras med epidemiologiska data och korreleras till sannolikheten för infektion och spridning av ESBL-producerande bakterier samt spridningen av ESBL-gener.

Referenser

1) AnagnosTec, Gessellschaft für Analytische Biochemie und Diagnostik mbH. 2008 http://www.anagnostec.eu/home.html.

2) Bush K. 2001. New β-lactamases in Gram-negative bacteria: diversity and impact on the selection of antimicrobial therapy. Clin Infect Dis 32: 1085-1089.

3) Bush K., G.A. Jacoby, A.A. Medeiros. 1995. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1211-1233.

4) Camara, J.E., F.A. Hays. 2007. Discrimination between wild-type and ampicillin-resistant Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight spectrometry. Anal. Bioanl. Chem. 389: 1633-1638.

5) Diekema, D.J., K.J. Dodgson, B. Sigurdardottir, M.A. Pfaller. 2004. Rapid detection of antimicrobial-resistant organism carriage: an unmet clinical need. J. Clin. Microbiol. 42: 2879-2883.

6) Delmas J., F. Breysse, G. Devulder, J.-P. Flandrois, M. Chomarat. 2006. Rapid identification of Enterobacteriaceae by sequencing DNA gyrase subunit B encoding gene. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 55: 263-268.

7) Demirev, P.A., A.B. Feldman, P. Kowalski, J.S. Lin. 2005. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Anal. Chem. 77: 7455-7461.

8) Fang, H., C. Lundberg, B.Olsson-Lilequist, G. Hedin, E. Lindbäck, Å. Rosenberg, J. Struwe. 2004. Molecular epidemiological analysis of Escherichia coli isolates producing extended-spectrum β-lactamases for identification of nosocomial outbreaks in Stockholm, Sweden. J. Clin. Microbiol. 42: 5917-5920.

9) Hawkey, P:M. 2008. The growing burden of antimicrobial resistance. J. Antimicrob. Chemother. 62: i1-i9.

10) Jacoby, G.A. 2006. β-lactamase nomenclature. Agents Chemother 50: 1123-1129.

11) Knothe, J., P. Shah, V. Kremery, M. Antal, S. Mitsuhashi. 1983. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infect. 11: 315-317.

12) Lytsy, B., L. Sandegren, E. Tano, E. Torell, D.I. Andersson, Å. Melhus. 2008. The first major extended-spectrum β-lactamase outbreak in Scandinavia was caused by clonal spread of a multiresistant Klebsiella pneumoniae producing CTC-M-15. APMIS. 116: 302-308.

13) Maiden MC, JA Bygraves, E. Feil, G- Morelli, JE Russell, R Urwin, Q Zhang, K Zurth, DA Caugant, JM Feavers, M Actman, BG Spratt. 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 3140-3145.

14) Marshall, A.G. 2000. Milestones in Fourier transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry technique development. Int. J. Mass Spectrom.

15) Melzer M, Petersen I. 2007. Mortality following bacteraemic infection caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E. coli compared to non-ESBL producing E. coli. J infect 55: 254-259.

16) Mollet, C., M. Drancourt, D. Raoult. 1997. Mol. rpoB sequence analysis as a novel basis for bacterial identification. Mol. Microbiol. Microbiol. 26: 1005-1011.

17) Nhung, P.H., K. Ohkuso, N. Mishima, M. Noda, M. Monir Shah, X. Sun, M. Hayashi, T. Ezaki. 2007. Phylogeny and species identification of the family Enterobacteriaceae based on dnaJ sequences. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 58: 153-161.

18) Noller, A.C., M.C. McEllistrem, A.G. Pacheco, D.J. Boxrud, L.H. Harrison. 2003. Multilocus variable-number tandem repeat analysis distinguishes outbreak and sporadic Escherichia coli O157:H7 isolates. J. Clin. Microbiol. 41: 5389-5397.

19) NorDiag. 2008. http://www.nordiag.com/index.php?option=com_content&view= article&id= 82&Itemid=84.

20) Paradis, S., M. Boissinot, N. Paquette, S.D. Belanger, E.A. Martel, D.K. Boudreau, F.J. Picard, M. Ouellette, P.H. Roy, M.G. Bergeron. 2005. Int. J. System. Evol. Microbiol. 55: 2013-2025.

21) Pfaller, M.A., J. Segreti. 2006. Overview of the epidemiological profile and laboratory detection of extended-spectrum β-lactamases. Clin. Inf. Dis. 42: S153-S163.

22) Pitout, J.D.D., K. Laupland. 2008. Extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: and emerging public-health concern. Lancet. 8: 159-163.

23) Roggenkamp A. 2007. Phylogenetic analysis of enteric species of the family Enterobacteriaceae using the oriC-locus. Syst Appl Microbiol 30: 180-188..

24) Stürenburg, E., N. Storm, I. Sobottka, M.A. Horstkotte, S. Scherpe, M. Aepfelbacher, S.
Müller. 2006. J. Clin. Microbiol. 44: 909-915.

17) Smittskyddsinstitutet. 2008. Statistik för extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL). http://www.smittskyddsinstitutet.se/statistik/extended-spectrum-beta-lactamase-esbl/#statistics-nav

18) Struwe, J. 2008. Fighting antibiotic resistance in Sweden – past, present and future. Wien. Klin. Wochenschr. 120: 268-279.

19) Stürenburg E, N. Storm, I. Sobottka, M.A. Horstkotte, S. Scherpe, M. Aepfelbacher, S. Müller. 2006. Detection and genotyping of SHV beta-lactamase variants by mass spectrometry after base-specific cleavage of in vitro-generated RNA ranscripts. J. Clin. Microbiol. 44: 909-915.

20) Sun, L., K. Teramoto, H. Sato, M. Torimura, H. Tao, T. Shintani. 2006. Chearacterization of ribosomal proteins as biomarkers for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectral identification of Lactobacillus plantarum. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 20: 3789-3798.

21) SWEDRES. 2005. http://soapimg.icecube.snowfall.se/strama/Swedres%202005.pdf.

22) Thomson, K.S., E.S. Moland. 2001. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 3548-3554.

23) Wiegand, I., H.K. Heinrich Geiss, D. Mack, E. Stürenburg, H. Seifert. 2007. J. Clin. Microbiol. 45: 1167-1174.

24) Williams, T.L., D. Andrzejewski, J.O. Lay, S.M. Musser. 2003. Experimental factors affecting the quality and reproducibility of MALDI TOF mass spectra obtained from whole bacteria cells. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14: 342-351.
25) Wong RSY, AW Chow. 2002. Identification of enteric pathogens by heat shock protein 60 kDa (HSP60) gene sequences. FEMS Microbiol Lett 202: 107-113.

Bilagor

Bilagor 1.pdf

Bilagor 1. Overview of the Saramis Work Flow protocol for preparing a single colony of the bacterial sample for MS analysis, example of mass spectrum and entry of protein mass data into the SARAMIS databases for comparative analysis.
Filstorlek: 111 kB

Bilagor 2.pdf

Bilagor 2. Protein "fingerprint" comparing different species of Enterobacteriaceae. Closely related bacteria are able to be differentiated by their characteristic mass spectra. These data are then processed by cluster analysis within the SARAMIS database for identifications.
Filstorlek: 606 kB