Fortsatt arbete med snabb nukleinsyrebaserad typning av bakterieisolat
Registration number: RFR-86541
Ansökan om anslag RFR 1 oktober 2009
Application started by: Jonas Blomberg, 2009-10-01
Professional title at the time of application: Professor/Överläkare
Work place at the time of application: Akademiska Sjukhuset, Uppsala +Uppsala Universitet, Inst. för medicinska vetenskaper, klinisk virolo
Last updated / corrected by: Marianne Omne-Pontén, 2010-04-16
Application received by: Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Granted, recipient of funds reported

Applicant: Jonas Blomberg
Läkare, Akademiska Sjukhuset, Uppsala +Uppsala Universitet, Inst. för medicinska vetenskaper, klinisk virolo

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

kvinna
man

Sökandes organisatoriska hemvist i landstinget

Annat

Kategorisering av ansökan

utgör ett helt nytt projekt
utgör ny delstudie på tidigare genomfört och avslutat projekt med RFR-stöd
utgör ny delstudie i pågående projekt med stöd från RFR
utgör ny delstudie i pågående projekt med stöd från andra nationella/internationella finansiärer
utgör ny ansökan på projekt som tidigare erhållit avslag från RFR
annat

För fortsättningsanslag

ja beviljats medel 1 gång

Tidigare RFR-anslag

Snabb nukleinsyrebaserad typning av bakterieisolat. Våren 2009

Sammanfattning

Vi vill stärka diagnostiken vid blodfögiftning (sepsis) i regionen, f.a. Västerås, Örebro och Uppsala. Ansökan gäller en ny typ av nukleinsyrebaserad mikrob-påvisning, som beräknas kunna komma i bruk på ganska kort sikt. Se stödjebrev från professor Jan Sjölin, infektionskliniken i Uppsala. Vi vill föra ut tekniken till regionlaboratorierna. Nyligen har Örebro skaffat en Luminexmaskin, vilket möjliggör körningar på plats.
Det finns ett stort kliniskt behov av att kunna upptäcka många mikrober (bakterier, svampar och virus) samtidigt. Det kommer att ha många positiva effekter. Det kommer att effektivisera och förbilliga mikrobiologisk diagnostik. Teknikerna har också potentialen att på sikt bidra till att föra ut mikrobiologisk diagnostik till primärvården.
Positiva blododlingar, som larmat i BactAlertsystemet, nukleinsyreextraheras, förstärks och identifieras med hybridisering till mikrobspecifika prober bundna till färgkodade kulor i en flödescytometer (Luminex). Det har stor kapacitet i antal prover och antal samtidiga analyser per prov, och arbetar snabbt. För att utnyttja instrumentet krävs en egen utvecklingsinsats, som Uppsala nu kommit långt med, och är redo att fortsätta utvecklingen av, tillsammans med Örebro och Västerås. Ett sepsisdiagnostiskt block innehållande 22 komponenter som prober för de i blododlingar vanligast förekommande bakteriearterna har konstruerats. Antibiotikaresistens (ESBL, VRE, MRSA och AmpC ingår.

---

Medarbetare/Medsökande

Per Olcén
Läkare, Laboratoriemedicinska kliniken/Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Örebro

Christina Öhrmalm
Annan tjänstetitel, Klinisk Virologi, Institutionen för medicinsk vetenskap, Uppsala Universitet

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Akademiska Sjukhuset

magnus jobs
Annan tjänstetitel, Högskolan Dalarna

Arbetsenhet:

Högskolan Dalarna och Klinisk Mikrobiologi. Akademiska Sjukhuset

Daniel Heimer
Läkare, Laboratoriemedicin, Unilabs

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Västerås

Magnus Thore
Läkare, Klinisk Mikrobiologiska Laboratoriet, Västerås

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Västerås

Åsa Melhus
Läkare, Dept of Clinical Microbiology

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Akademiska Sjukhuset

Björn Herrmann
Annan tjänstetitel, Akademiska sjukhuset, Klinisk mikrobiologi, Uppsala

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Akademiska sjukhuset

Forskarutbildning

ingen doktorand är kopplad till studien

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

Mars 2010

Projektslut

Mars 2011

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Bakgrund och behov.
JB har skrivit en artikel som kortfattat belyser bakgrund och behov av multiplex nukleinsyrebaserad diagnostik inom mikrobiologin ( bifogas[1]). Som framgår av artikeln finns ett stort kliniskt behov av att kunna upptäcka många mikrober (bakterier, svampar och virus) samtidigt. Det kommer att ha många positiva effekter. Det kommer att effektivisera och förbilliga mikrobiologisk diagnostik. Teknikerna har också potentialen att på sikt bidra till att föra ut mikrobiologisk diagnostik till primärvården.

Diagnostiska frågeställningar:
I dagsläget kan positiva blododlingar, som larmat i BactAlertsystemet, i viss mån snabbt typas med mikroskopi och agglutinationsreaktioner. Många egenskaper kräver dock en odling 1-2 dygn innan de har fastställts. Gängse bakteriediagnostik bygger på fenotypiska artkaraktärer för typning. Till det kommer behovet att fastställa resistens mot flera olika antibiotika, vilket ytterligare komplicerar den konventionella arbetsgången.
Den ofta pressade kliniska situationen kräver ett system som inom 1-2 timmar kan preliminärtypa positiva blododlingar, och ge en indikation på förekomsten av eventuella antibiotikaresistensgener.
Det finns kommersiella genotypningssystem som täcker en del av behovet, men de kan inte modifieras efter det enskilda laboratoriets behov, och har inte fått stor användning i Sverige.

Genotypning kontra fenotypning
Hela mikrobiologin genomgår just nu en revolution, där etablerade, fenotypiskt baserade, metoder kompletteras med genotypiskt baserade. Under lång tid kommer genotypiska metoder inte att kunna ersätta de fenotypiska. En orsak är kunskapsläget. För många bakteriearter har inte lämpliga genotypiska artkaraktärer slutgiltigt fastlagts. En annan orsak är det variabla innehållet av virulensfaktorer (ex.vis plasmider, patogenitetsöar, bakteriofagöverförda gener) hos många bakterier. Kliniskt viktiga egenskaper är alltså inte entydigt sammankopplade med genotypen för en viss bakterieart. Ett genotypiskt system kan alltså dels behöva ha med både artkaraktärer, virulenskaraktärer och antibiotikaresistenskaraktärer. Detta lilla projekt kan inte utreda denna stora fråga. Vi måste utgå från någorlunda etablerad kunskap och litteraturstudier.

Tidigare och preliminära resultat.
I JBs grupp har länge pågått utveckling av nukleinsyrebaserade brett riktade och kvantitativa tekniker för påvisning av virus och andra patogener (artikeln i Laboratoriet). SanntidsPCRbaserade metoder för Herpesgruppens virus (HSV, CMV och EBV), Enterovirus, Polyomavirus, Retrovirus, Coronavirus, Orthomyxovirus, Meningitbakterier och Luftvägsbakterier (pneumokocker, hemophilus och mykobakterier) har utvecklats, antingen inom gruppen, eller i samarbete med andra grupper.
Bioinformatiska dataprogram för påvisning och analys av virala sekvenser har också utvecklats (JB). Ett projekt för multiplex påvisning av mänskliga patogener har bedrivits i c:a ett år. Det föreligger redan resultat som visar att
-Hänglåsprober (ad modum Landegren-Nilsson) med hybridisering, ligering och förstärkning med rullande cirkel och vanlig PCR teknik kan användas för påvisning av mikrobiell nukleinsyra med kliniskt användbar känslighet. Tio olika svamppatogener kan påvisas med en reaktion (Ronnie Eriksson, Magnus Jobs et al, J Microbiol Methods 2009).
-Virusvariationen (som är ett diagnostiskt problem f.a. vid vinterkräksjuka, influensa, hepatit C och HIV) kan motverkas med 1. en noggrann bioinformatisk analys av lämpliga målsekvenser, 2. användning av långa prober, och 3. användning av generellt basparande nukleotidanaloger (Christina Öhrmalm et al, manus).
- CÖ och RE (Ronnie Eriksson) har i samråd med ÅM och BH utformat ett sepsis-
diagnostiskt block innehållande 22 komponenter som prober för många av de i
blododlingar vanligast förekommande bakteriearterna. Problemet med de
koagulasnegativa stafylokockerna (KNS), som är mycket lika Staphylococcus
aureus, har ägnats särskild uppmärksamhet. Upplägget och resultaten har
diskuterats vid samarbetsmöten med projektdeltagare i Västerås (DH & MT), och
i Örebro (PO & andra). Resultaten har redovisats vid det mikrobiologiska
vårmötet, och redovisas nu också vid en internationell diagnostisk kongress i
Amsterdam. Projektet har gått igenom största delen av Fas 1 i nedanstående
projektplan, i enlighet med tidsplanen.

Syfte/frågeställning/hypotes

Vi vill stärka diagnostiken vid blodfögiftning (sepsis) i regionen, f.a. Västerås, Örebro och Uppsala. På sikt kommer hela regionen att dra nytta av utvecklingen. Ansökan gäller en ny typ av nukleinsyrebaserad mikrob-påvisning, som beräknas kunna komma i bruk på ganska kort sikt. Se stödjebrev från professor Jan Sjölin, infektionskliniken i Uppsala.
Vi vill föra ut tekniken till regionlaboratorierna. Nyligen har Örebro skaffat en Luminexmaskin, vilket möjliggör körningar på plats.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

De tre ingående laboratorierna samlar sina sepsisisolat under testperioden, dvs ett år. De analyseras sedan med metoden i Uppsala och Örebro.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Projektet gäller fortsatt utveckling av ett multiplext typningssystem för blodförgiftningsbakterier. Det bygger på enkel nukleinsyremärkning, hybridisering med mikrobspecifika prober, och identifiering med färgkodade kulor i en flödescytometer (Luminex). Det har stor kapacitet i antal prover och antal samtidiga analyser per prov, och arbetar snabbt. För att utnyttja instrumentet krävs en påtaglig egen utvecklingsinsats. I Uppsala finns nu 2 1/2 års erfarenhet av det instrumentet. Det föreslagna systemet kan vara inkörsporten till många andra applikationer av nukleinsyrebaserad diagnostik inom mikrobiologin i regionen.

Detaljerad projektplan

Fas 1. Explorativ fas med undersökning av renstrukna isolat.
För ett år sedan skrev vi:
Syftet är att etablera en fungerande prob-panel, och detaljer i hybridiserings- och amplifieringsproceduren. Genotypningsmetoden kommer med stor sannolikhet att behöva modifieras under denna första fas, som enbart är på mikrobiell nivå. Tidsåtgång: c:a 6 månader.
Som framgår av redovisningen har vi kommit långt i denna fas.

Fas 2. Retrospektiv undersökning av positiva blododlingar.
Här studeras hur väl den snabba genotypningen utfaller jämfört med gängse metodik.
Cirka 50 positiva blododlingar från de deltagande laboratorierna. En insamling av positiva blododlingar måste alltså startas relativt snart.
Proverna analyseras anonymt, retrospektivt. Endast prover där patientens medgivande till "Diagnostik och därmed förenlig verksamhet" föreligger användes. Vi räknar inte med
att behöva kontakta behandlande läkare i denna del av studien. Inget behov av etiskt tillstånd föreligger. Tidsåtgång: c:a 3 månader.

Fas 3. Prospektiv studie av positiva blododlingar.
Om tiden medger studeras fortlöpande metodens funktion i en rutinsituation. Sensitivitet och specificitet beräknas. I denna fas kan ev. behandlande läkare behöva kontaktas om kliniskt relevant information framkommer.
Cirka 50 positiva blododlingar bör om möjligt ingå. Tidsåtgång: c:a 6 månader.

Vilken metod användes?
Metodiken kommer att vara den i JBs lab etablerade multidiagnostiska tekniken, som bygger på: Nukleinsyreextraktion. Hybridisering till färgkodade kulor. Analys i flödespartikelmätare (Luminex). Känsligheter är 10-1000 bakterier per reaktion. Specificiteten är god. Korsreaktioner mellan enterobakterier förekommer, men är inget stort diagnostiskt problem. En rapport bifogas.

Vilka bakterier och resistensgener ingår?
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, KNS, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococus faecium, Pseudomonas auruginosa, Candida dubliniensis, Klebsiella pneumoniae/oxytoca, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis. Resistensgenerna för VRE (vanA/B), ESBL (ctxm gr I och ctxm gr IV), MRSA (mecA) och Ampicillin-resistens (ampC) finns också med i panelen.I ett senare skede läggs Grupp A streptokocker och Alfastreptokocker till. Vi räknar med att det inte skall vara nämnvärda svårigheter att skapa en för rutinen användbar bredare panel inför Fas 3. Tid och pengar avgör hur ambitiös den skall vara.

Beskrivning av det regionala samarbetet

Projektet sker i samverkan mellan Klinisk Mikrobiologi, Västerås (där JB är konsult), Klinisk Mikrobiologi vid Universitetssjh i Örebro och Klinisk Mikrobiologi vid Akademiska sjukhuset i Uppsala. Samarbetet har hittills manifesterats i form av möten. Den multiplexa patogenpåvisningstekniken kommer från JBs lab, men har nu avancerat så att de övriga två laboratorierna kan bidra. Det gäller
1. Sparande och selektion av lämpliga bakterieisolat. De tre laboratoriernas samlade verksamhet behövs för att få en allsidig representation av sepsisisolat med och utan viktiga antibiotikaresistensgener.
2. Uppsättande av tekniken i Örebro, där en Luminexmaskin nu finns.
3. Jämförande analyser mellan den egna tekniken och andra typnings- och påvisningssystem. Här kan alla lab bidra.
3. Möten med litteraturgenomgång och redovisning av resultat, två gånger om året.
5. BMA från Västerås och Örebro kan komma till Uppsala för studier av tekniken, och för att sätta upp den i repektive laboratorium.

---

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är INTE gjord och planeras ej

Motivering

Varje patient tillfrågas om provet får användas för diagnostik av den typ vi utvecklar. Enbart prover med sådant godkännande analyseras.

---

Referenser

1. Blomberg J, Belak S (2007) Brett riktade och multiplexa mikrobdetektionsmetoder. Nutid och Framtid. Laboratoriet 1: 20-24.

2. Eriksson R, Jobs M, Ekstrand C, Ullberg M, Herrmann B, Landegren U, Nilsson M, Blomberg J. (2009) Multiplex and quantifiable detection of nucleic acid fron pathogenic fungi using padlock probes, generic real-time PCR and specific suspension array readout. J Microbiol Methods 78:195-202 .

3. Abdeldaim G. PCR detection of Streptococcus pneumoniae and Hemophilus influenzae in pneumonia patients. Avhandling, Uppsala och Örebro, 2009. Avhandlingen handlar om multiplex och kvantitativ PCR av viktiga luftvägspatogener. Den är ett samarbete mellan Klinisk mikrobiologi i Uppsala och Klinisk mikrobiologi/Infektionsklinik i Örebro.

Nyckelord

Inlagda MeSH-termer

Sepsis

Systemic inflammatory response syndrome with a proven or suspected infectious etiology. When sepsis is associated with organ dysfunction distant from the site of infection, it is called severe sepsis. When sepsis is accompanied by HYPOTENSION despite adequate fluid infusion, it is called SEPTIC SHOCK.

Biotechnology

Body of knowledge related to the use of organisms, cells or cell-derived constituents for the purpose of developing products which are technically, scientifically and clinically useful. Alteration of biologic function at the molecular level (i.e., GENETIC ENGINEERING) is a central focus; laboratory methods used include TRANSFECTION and CLONING technologies, sequence and structure analysis algorithms, computer DATABASES, and gene and protein structure function analysis and prediction.

Early Diagnosis

Methods to determine in patients the nature of a disease or disorder at its early stage of progression. Generally, early diagnosis improves PROGNOSIS and TREATMENT OUTCOME.

Diagnosis, Differential

Determination of which one of two or more diseases or conditions a patient is suffering from by systematically comparing and contrasting results of diagnostic measures.

Bacterial Infections and Mycoses

Infections caused by bacteria and fungi, general, specified, or unspecified.

C Bilagor

Bilagor

Stödjebrev Sjölin.doc

Professor Jan Sjölin, Akademiska Sjukhuset, stödjer projektet.
Filstorlek: 27 kB

CÖ 30sept09 Typning av positiva blododlingar med en multiplex förstärkningsteknik[1].doc

Redovisning av resultat från föregående projektomgång (som fortfarande pågår). Vi har uppnått de flesta av de mål vi hade i föregående ansökan.
Filstorlek: 38 kB

Detaljerad forskningsplan, regionansökan Blododlingar Luminex Oktober 2009.doc

Detaljerad forskningsplan
Filstorlek: 54 kB

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

2 970 000

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

1. Christina Öhrmalm: är "motorn" i projektet, driver både labbande, omedelbar försöksplanering, primer/prob design och skrivande.

2. BMA från Västerås och Örebro. Lär sig tekniken av Christina, sätter upp i Örebro (s0m har en Luminex), och i Västerås (som äskar en Luminex hos sin huvudman)

Driftsmedel

En mindre del äskas från RFR.

Utrustning

-

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Tekniken har redan visat sig klara att typa bakterioislat från patienter med sepsis. Det som nu behövs är optimering och tillägg/justering av några primer/prober. Då kan tekniken köras i kliniskt bruk med kort varsel. Projektet är alltså mycket patientnära, och potentiellt livräddande (se an Sjölins stödjebrev).

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Som skrivs ovan, och av Jan Sjölin, har det stor betydelse att snabbt kunna typa sepsisbakterier, och översiktiligt klargöra deras antibiotikaresistens. Självklart kommer konventionell bakteriologisk teknik att också behövas för att verifiera och för att detaljera resultatet.

Bedömning av projektets vetenskapliga angelägenhetsgrad

Projektet befinner sig i den vetenskapliga framkanten. Veterligen finns ingen teknik som har alla egenskaper hos tekniken: 1. Infångning från stora provvolymer, 2. Variationstolerans, 3. Känslighet, 4. Specificitet, och 5. Snabbhet.
Trots det är alla komponenter i tekniken beprövade, alltså inget "månskott".

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

De tre laboratorier bildar en optimal helhet, av flera orsaker:
I Uppsala har tekniken utvecklats. Dät finns också en medelstor sepsisdiagnostik (provtillgång).
I Örebro finns en lång erfarenhet av molekylärbiologiska metoder inom bakteriologin.
Sepsisdiagnostiken har ägnats särskilt intresse. Där finns också en relativt god provtillgång.
I Västerås finns en gos basdiagnostik för sepsis, och en relativt god provtillgång.
Eftersom metoden skall klara de flesta sepsisbakterier behövs det samlade provmaterialet och den samlade erfarenheten från de tre laboratorierna.

Vi har träffats flera gånger under det gångna året, och samarbetsfrågor har då kommit upp.

Publicering

Ännu så länge har ingen gemensam publikation kommit fram, metoden måste prövas på labben dessförinnan. Men det kommer.

---

F Vetenskaplig redovisning - gäller endast för fortsättningsansökningar

Rapporteringsläge

Lägesrapport

Rapporteringsdatum

2009-09-30

Vetenskaplig progress och studiens genomförande

Se bilaga från Christina Öhrmalm

Resultat

Se bilaga från Christina Öhrmalm

Ekonomisk redovisning

Projektet pågår fortfarande

Medverkan på RFRs FoU-dag den 16 februari 2010

Jo, vi skall vara med

Populärvetenskaplig sammanfattning av resultat

Vi har utvecklat en teknik för typning av blodförgiftningsbakterier, som också talar om om bakterien sannolikt är motståndkraftig mot vanliga antibiotika. metoden kan snabba upp typningen av sådana bakterier och hjälpa vården att välja rätt antibiotikum.

Planerad spridning och implementering

Metoden kommer att publceras inom några månader, sedan kommer flera artiklar om det kliniska genomförandet.