Kartläggning av tjock- och ändtarmstumörers molekylära fenotyp samt dess relation till histopatologiskt utseende och prognos.
Diarienummer : RFR-33991
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Helgi Birgisson, 2008-09-29
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Kolorektal kirurg
Arbetsplats vid ansökningstillfället : Kirurg kliniken, Centrum för klinisk forskning Uppsala universitet, Västerås
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2011-11-02
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Helgi Birgisson
Läkare, Institutionen för kirurgiska vetenskaper, Kolorektalkirurgi, Uppsala universitet, Uppsala

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

Sammanfattning

Målsättningen för denna studie är att kartlägga mutationsstatus i nyckelgener, samt att generera och analysera genomiska profiler i vävnadsprover från två grupper av patienter med tjock- eller ändtarmscancer. Vävnadsprover till studien väljs ut från Uppsala Biobank och Västeråskohorten baserat på en klinisk och histopatologisk bedömning. DNA extraheras från frusen vävnad innehållande minst 50% tumörceller och används till mutationsanalyser och en genomiska kartläggning. Mutationsanalyser av extraherat DNA sker i samarbete med avdelningen för Molekylärpatologi och fokuseras på generna för K-Ras, BRAF och PI3K eftersom dessa ofta är muterade i tjock- och ändtarmstumörer. Dessa proteiner ingår dessutom i signaleringsvägar som styr egenskaper hos celler som är av stor betydelse för tumörutveckling. Mutationsanalyser för K-Ras och BRAF finns etablerade medan protokoll för analys av PI3K kommer att utvecklas på avdelningen för Molekylärpatologi. Övergripande analyser av genomiska profiler sker med så kallade ”SNP-microarrays”. Dessa analyser sker i samarbete med Uppsala Array Platform och genererar högupplöst data för kromosomförändringar och antal genkopior. Slutligen sammanställs kliniska data, mutationsdata och de genomiska profilerna för en utvärdering av användbara prognostiska och behandlingsprediktiva faktorer.

Det är av största vikt att utöka den molekylära kunskapen för tjock- och ändtarmscancer som tillhör de vanligaste tumörformerna i världen. Denna kunskap skulle inte bara medföra en mer individualiserad behandling för patienter som opererats för tjock- och ändtarmscancer, utan även en ökad förståelse för underliggande tumörmekanismer samt kartläggning av prognostiska och prediktiva molekylära signaturer i tumören.

---

Medarbetare/Medsökande

Magnus Sundström
Annan tjänstetitel, Akademiska Sjukhuset, Molekylär Patologi

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Nej

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Anders Isaksson
Annan tjänstetitel, Uppsala Array Platform

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Nej

Arbetsenhet:

Uppsala Array Platform

Bengt Glimelius
Läkare, Onkologiklinken, Akademiska sjukhuset, Uppsala

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Ja

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Lars Påhlman
Läkare, Kirurgisk Kliniken, Akademniska Sjukhuset, Uppsala

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Ja

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Patrick Micke
Läkare, Molekylerpatologen Rudbecklaboratoriet Akademiska Sjukhuset

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Ja

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Ulrik Wallin
Läkare, Akademiska Sjukhuset

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Nej

Patientrekrytering:

Ja

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2009-01-01

Beräknat projektslut

2009-09-30

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Cancer i tjock- och ändtarmen är den näst vanligaste cancerformen och leder i världen till döden för ca en halv miljon människor varje år (Nordman, Iyer et al. 2006). I Sverige är incidensen för tjock- och ändtarmscancer ca 5/10000 per år och medianåldern för insjuknande är 74 år (ROC 2002). Kirurgi är den primära behandlingsmetoden och är den faktor som starkast associeras till patientens överlevnad. Prognosen vid tjock- och ändtarmscancer påverkas dock av flera andra olika faktorer som allmänt kan klassificeras relaterat till tumörstadium, kliniska faktorer, histopatologiskt utseende, onkogenetiska, molekylära samt immunologiska faktorer. För patienter opererade för tjock- eller ändtarmscancer utgör tumörstadium samt faktorer som direkt eller indirekt påverkar tumörstadiet av primärtumören idag de viktigaste prognostiska faktorerna.
I Sverige erbjuds patienter som opererats för tjock- och ändtarmscancer, beroende på vilket tumörstadium de tillhör, tilläggsbehandling med adjuvant kemoterapi för att minska risken för återfall och förtida död. Patienter med stadium I cancer, där tumören enbart växer ytligt i tarmväggen och ingen spridning till lymfkörtlar finns, har en god prognos med 85-100% beräknad sjukdomsfri 5-års överlevnad varför dessa ej erbjuds adjuvant kemoterapi. Hos patienter där tumören växer igenom tarmväggens muskellager men fortfarande är begränsad till tarmväggen (stadium II), eller där tumören spridit sig till lymfkörtlar (stadium III), är den sjukdomsfria 5-års överlevnaden 65-75% respektive 36-74% (ROC 2002; Benson 2006). Av dessa två grupper ges enbart rutinmässigt adjuvant kemoterapi till patienter opererade för tjocktarmscancer i stadium III, samt till patienter med stadium II tumörer som anses ha histopatologiska högrisk kriterier (Cianchi, Messerini et al. 2007). Cirka 20% av alla patienter med stadium II tumörer förväntas få återfall och en del av dessa patienter skulle ha varit i behov av adjuvant kemoterapi, samtidigt som 50-70% av patienter med stadium III tumörer ej får återfall varför det i dagens läge sker en överbehandling av denna grupp. Med bakgrund av detta finns en önskan att kunna identifiera hög eller lågrisk patienter så att den postoperativa behandlingen kan individualiseras och skräddarsys på ett effektivare sätt än vad som är möjligt i dag.
Tjock- och ändtarmscancer utgörs till 95% av körtelbildande tumörer och anses oftast härröra från adenom. Utvecklingen från adenom till adenocarcinom är beskrivet som en stegvis process som inkluderar två separata initierande faktorer: mikrosatellit instabilitet eller kromosom instabilitet, som i sin tur leder till utveckling av adenocarcinom (Fearon and Vogelstein 1990). Kromosomförändringar och mutationer i specifika onkogener eller tumörsuppressorgener representerar avgörande molekylära händelser under tumörutveckling (Leslie, Pratt et al. 2003). Från studier av kända tillstånd med hereditär tjock- och ändtarms cancer som FAP (familial adenomatous polyposis) och HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) har kunskapen om hur olika mutationer i gener som t ex APC (Adenomatous Polyposis Coli) och MMR (Mismatch Repair Gene) ökat och att även liknande mutationer kan påvisas i sporadiska fall av tjock- och ändtarmscancer. Nyligen har en helt ny molekylärbiologisk klassificering av tjock- och ändtarmscancer förslagits där fem skilda typer beskrivs (Jass 2007). Det finns idag alltså anledning att tro att vi förutom rutinpatologin kan driva diagnostiken vidare molekylärbiologiskt för att kunna optimalt definiera de patienter som är i behov respektive inte behov av ytterligare behandling och i förlängningen ge en behandling som är effektiv mot individens tumörceller.
Under de senaste åren har stora framsteg gjorts i behandling av tjock- och ändtarmscancer. Dessa beror delvis på att standardbehandling nu kombineras med en ny generation av läkemedel målinriktade mot intracellulära signaleringsmolekyler med betydelse för utveckling av tjock- eller ändtarmscancer. Ett särskilt viktigt mål för denna grupp av läkemedel är ”epidermal growth factor receptor” (EGFR). När epidermal growth factor binder EGFR aktiveras denna receptor genom auto-fosforylering, vilket följs av en initiering av intracellulära signalerings-nätverk. Aktiverade signaleringsvägar inkluderar ”Ras/Raf/Mitogen-activated protein kinase” samt ”phosphatidylinositol 3-kinase” (PI3K)/Akt. Mutationer i gener som kodar för proteiner i dessa signaleringsvägar leder till en felreglering av den cellulära signaleringen. Detta har visat sig medverka både till tumörutveckling och den metastatiska processen, genom en påverkan av cellernas förmåga till migration (förflyttning), proliferation, överlevnad samt differentiering.
Två olika varianter av EGFR-hämmare används nu i behandling av tjock- och ändtarmscancer. Dessa läkemedel som blockerar signalering nedströms EGFR har särskilt visat lovande resultat för en viss grupp av patienter med metastaserande tumörer. Avgörande för om patienten svarar på behandlingen är mutationsstatus för onkogenen K-Ras. Endast patienter med omuterad K-Ras har möjlighet att svara på anti-EGFR-behandling {Amado, 2008; Lievre, 2008; Lievre, 2006). Det är mycket sannolikt att andra signaleringsmolekyler nedströms EGFR också bidrar till behandlingsresponsen hos patienter med tjock- eller ändtarmscancer {Barault, 2008}.

Syfte/frågeställning/hypotes

Att undersöka den molekylära fenotypen hos tjock- och ändtarmstumörer samt finna kliniskt användbara prognostiska och behandlingsprediktiva faktorer.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

Åren 1985-2002 har tumörvävnad samlats vid kirurg kliniken i Uppsala. Förutom rutinpatologi finns frysta bitar samt tillhörande paraffinklossar. Klinisk information med uppföljning finns på alla patienter. Materialet har redan använts för analys av polymorfier i ECP-genen (isolerat DNA finns på ungefär 230) och för förekomst av eosinofila granulocyter. Detta material är väl lämpligt att användas för att värdera prognos vid primär colorektalcancer då det är stort, inte selekterat och med lång uppföljning. Ur detta material har en kohort med totalt 40 patienter specifikt selekterats fram med 20 fall som det gått bra för och 20 fall som det gått dåligt för med stadium II och III tumörer. Dessa 40 patienter kommer att undersökas i första hand. Om en specifik teknik fungerar väl och om den fr.a. ger antydan om att kunna diskriminera mellan stadium och prognos kommer hela materialet att undersökas för den eller de faktorerna.
Om analyserna funkerar bra kommer vi att fortsätta analyserna på Västeråskohorten och material ifrån Uppsala biobank.

Västerås kohorten

Under tidsperioden 2000-06-01 till 2003-12-31 samlades frysta tumör- och slemhinnebitar, serum och plasma från 337 patienter med kolon och rektal cancer vid kirurgkliniken, Centrallasarettet, Västerås.
Från varje patient: Fyra 5x5x5 mm stora färska tumörvävnadsbitar. Proverna nedfryses och förvaras i –70 gr.
Själva undersökningen påverkade ej patientens behandling. Patienten opererades på sedvanligt sätt och erbjuds den för tiden aktuella tilläggsbehandlingen.
Information om adjuvant behandling, tumörstadium och differentieringsgrad har samlats in. Information om cancerrecidiv och överlevnad samlas regelbundet in och median uppföljningstid nu är 5 år.
Materialet har förberätts för tma med åtta tma klossar, 10x12 stansar per kloss, med två 1 mm stansar från primärtumör och en 1mm stans från lymfkörtelmetastaser samt angränsande normal mucosa om tillgängligt.

Biobanksvävnad

I Uppsala Fresh Tissue Biobank finns närmare 30000 nedfrysta tumörbitar insamlade från 1978 och framåt. Dessa vävnadsprover har blivit snabbfrysta 0,5-3 timmar efter operation och förvaras i kryorör i –80°C. Baserat på våra tidigare studier samt en utredning tillsammans med det svenska nationella biobanksprogrammet, förväntar vi oss att merparten av det samlade vävnadsproverna innehåller DNA av fullgod kvalitet (Ref. Micke P, Lab Invest 86, 202-11; 2006; www.biobanks.se se Biobank Program, WP 5.1, reports). All vävnad från tjock- eller ändtarmstumörer som kommer att användas i denna studie väljs ut från Uppsala Biobank utifrån en histopatologisk bedömning av en verksam patolog i projektgruppen. För att kunna utföra en genetisk kartläggning med hög upplösning, och analysera för mutationer i gener för intracellulära signaleringsproteiner, kommer DNA att extraheras från frusen vävnad innehållande minst 50% tumörceller.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

I detta projekt kommer vi fokusera våra mutationsanalyser på generna för K-Ras, BRAF och PI3K eftersom dessa ofta är muterade i tumörvävnad från tjock- eller ändtarmscancer {Barault, 2008}{Samuels, 2005}.
För att få insyn i genomiska förändringar av betydelse för utveckling av tjock- och ändtarmscancer samt behandlingsrespons kommer vi i detta projekt även arbeta med microarray analyser för ”single nucleotide polymorphisms” (SNP). Med hjälp av denna övergripande analys detekteras dels specifika förändringar i det globala antalet genkopior, och dessutom kartläggs ”loss of heterozygosity” (LOH) för hela genomet. För denna typ av microarray-analyser behövs endast små mängder DNA.

Pyrosequencing-analys av mutationer i K-Ras och BRAF

Avdelningen för Molekylärpatologi vid Institutionen för Patologi och Cytologi har utarbetat protokoll och metoder för analys av mutationer i K-Ras och BRAF. DNA extraherat från tumörvävnad analyseras med Pyrosequencing, en sekvenseringsmetod med allel-kvantifierings-kapacitet. För närvarande utförs K-Ras-diagnostik med denna teknik rutinmässigt för alla nyopererade fall med tjock- eller ändtarmscancer. Under 2008 har närmare 100 patienter analyserats för K-Ras mutationer i Uppsala.

Sekvensering av PI3K (mutationsanalys)

Extraherat DNA kommer även att PCR-amplifieras och analyseras för mutationer i genen för p110α-delen av PI3K. Protokoll för analysen kommer att utvecklas vid avdelningen för Molekylärpatologi och baseras på Sanger-sekvensning av exonerna 1, 2, 9 och 20. I dessa exoner har i stort sett samtliga identifierade mutationer i PI3K påträffats (Samuels, 2005).

Högupplöst genetisk kartläggning

DNA från tumörvävnad kommer även karakteriseras för övergripande genomiska förändringar i de två patientgrupperna. Denna del av projektet genomförs tillsammans med Uppsala Array Platform med hjälp av ”high-density oligonucleotide arrays” för att analysera SNP-status i provernas DNA. Denna teknik ger högupplöst information om generella kromosomavvikelser som inkluderar: förändringar av antalet kromosomer, förlust av specifika delar av kromosomer och förändringar av antalet genkopior. Avdelningen för Molekylärpatologi har tidigare haft framgångsrika samarbetsprojekt med Anders Isaksson vid Uppsala Array Platform. Dessa projekt har behandlat liknande frågeställningar angående genomiska förändringar i DNA från tumörvävnad. Därför förväntar vi oss att kunna generera data av hög kvalitet även inom denna studie.

Studiens genomförande

Det aktuella projektet har ett startdatum i januari 2009 och en beräknad avslutning i månadsskiftet augusti-september 2009. Se nedan för mer specificerade tidsangivelser.

Januari 2009:

Identifiering och framtagande av tumörvävnad från Biobank
Histopatologisk utvärdering
Uppsättning och utvärdering av protokoll för PI3K mutationsanalys

Feb-april 2009:

Snittning av fryst vävnad
DNA extraktion
Mutationsanalyser (K-Ras, BRAF, PI3K)
SNP array körningar

Maj-augusti 2009:

Sammanställning av mutations- och array-data.
Bioinformatiska och statistiska analyser av arraydata

Ytterligare två medarbetare bör nämnas det är Johan Botling biobanksansvarig på patologen i Uppsala samt Hanna Göransson på Uppsala Array Platform som hjälper till med bioinformatik.

---

Forskningsetiska överväganden

Studien är i sin helhet godkänd av etikprövningsnämnden vid Uppsala universitet.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

2000-03-30

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

00-001 26/1 2000

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

Amado, R. G., M. Wolf, et al. (2008). "Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer." J Clin Oncol 26(10): 1626-34.

Barault, L., N. Veyrie, et al. (2008). "Mutations in the RAS-MAPK, PI(3)K (phosphatidylinositol-3-OH kinase) signaling network correlate with poor survival in a population-based series of colon cancers." Int J Cancer 122(10): 2255-9.

Benson, A. B., 3rd (2006). "New approaches to the adjuvant therapy of colon cancer." Oncologist 11(9): 973-80.

Cianchi, F., L. Messerini, et al. (2007). "Pathologic determinants of survival after resection of T3N0 (Stage IIA) colorectal cancer: proposal for a new prognostic model." Dis Colon Rectum 50(9): 1332-41.

Fearon, E. R. and B. Vogelstein (1990). "A genetic model for colorectal tumorigenesis." Cell 61(5): 759-67.

Jass, J. R. (2007). "Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical, morphological and molecular features." Histopathology 50(1): 113-30.

Leslie, A., N. R. Pratt, et al. (2003). "Mutations of APC, K-ras, and p53 are associated with specific chromosomal aberrations in colorectal adenocarcinomas." Cancer Res 63(15): 4656-61.

Lievre, A., J. B. Bachet, et al. (2008). "KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab." J Clin Oncol 26(3): 374-9.

Lievre, A., J. B. Bachet, et al. (2006). "KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer." Cancer Res 66(8): 3992-5.

Nordman, I. C., S. Iyer, et al. (2006). "Advances in the adjuvant treatment of colorectal cancer." ANZ J Surg 76(5): 373-80.

ROC (2002). "Vårdprogram och register för kolorektal cancer. ."

Samuels, Y., L. A. Diaz, Jr., et al. (2005). "Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells." Cancer Cell 7(6): 561-73.

C Bilagor

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

350 000

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Projketet är patientnära. Alla patienter har tilfrågast inför operation om att lämna tumörvävnad för analys och är därmed väl medvetna om det planerade projektet. Data är insamlade avseende behandling, tumörstadium, recidiv och överlevnad. Detta gör att aktuella analyser av tumörmaterialet kan kopplas till kliniska parametrar och för att se den prediktiva eller prognostiska betydelsen.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Det är av största vikt att utöka den molekylära kunskapen för tjock- och ändtarmscancer som tillhör de vanligaste tumörformerna i världen. Denna kunskap skulle inte bara medföra en mer individualiserad behandling för patienter som opererats för tjock- och ändtarmscancer, utan även en ökad förståelse för underliggande tumörmekanismer samt kartläggning av prognostiska och prediktiva molekylära signaturer i tumören.

Sammanfattningsvis är målsättningen för det aktuella projektet att kombinera expertis inom molekylärbiologi och patologi i analyser av två grupper av patienter som skiljer sig åt med avseende på behandlingsrespons och överlevnad. Den molekylärbiologiska fenotypen och tumörens histopatologiska egenskaper kommer att sättas i relation till kliniska patientdata för att kartlägga prediktiva och prognostiska molekylära signaturer för tjock- och ändtarmscancer.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

Studien är ett regionalt samarbete eftersom stor av tumörvävnaden coh den kliniska infromationen har insamlas i Västerås av Helgi Birgisson som arbetar där. Största delen av analyserbetet görs vid molekylärpatalogien i Uppsala men resultat och utvärdering utförs av båda parter.

Publicering

Clinical cancer research

---