Realtids-PCR av 16 S rRNA genen för diagnostik av sepsis hos vuxna och nyfödda, en prospektiv jämförelse mot blododling.,
Diarienummer : RFR-32981
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Andreas Ohlin, 2008-09-29
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Avdelnings läkare
Arbetsplats vid ansökningstillfället : Barnkliniken USÖ
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2009-05-25
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Andreas Ohlin
Läkare, Barnkliniken USÖ

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

För projekt som beviljats medel av RFR

RFR-9644 : Realtids-PCR av 16 S rRNA genen för diagnostik av sepsis hos vuxna och nyfödda, en prospektiv jämförelse mot blododling. Våren 2007 100 000 kr.
RFR-12564 : Realtids-PCR av 16 S rRNA genen för diagnostik av sepsis hos vuxna och nyfödda, en prospektiv jämförelse mot blododling. 071130 100 000 kr.

Sammanfattning

Sepsis är en sjukdom som kännetecknas av tre besvärande faktorer: Det är en förhållandevis vanlig, allvarlig sjukdom som är svår att diagnostisera, framförallt hos nyfödda och vuxna med sänkt immunförsvar. Detta gör att patienter både över- och underbehandlas för sepsis. Många friska patienter får behandling i onödan pga att det inte finns något pålitligt instrument för att utesluta en säker infektion. Andra patienter kan få behandlingen för sent eftersom de initiala tecknen är diskreta och svårtolkade. Mot den bakgrundan genomför vi nu en prospektiv studie för att utvärdera om realtids-PCR av bakteriens 16 S gen kan förbättra diagnostiken av sepsis. Vi har i en tidigare studie presenterat en PCR-metod som klarar att detektera alla viktigaste bakterier som orsaker sepsis hos nyfödda. Tyvärr var dock sensitiviteten i denna studie för låg för att kunna användas i kliniskt bruk. Provhanteringen har nu förbättrats och vi avser att samla prover från både vuxna och nyfödda med misstänkt sepsis för att utvärdera om sensitiviteten är påtagligt bättre med denna hantering. För de vuxna patienterna kommer metoden också att kunna jämföras med en kommersiellt tillgänglig PCR-metod, septi-Fast.

Inklusionskriterie till studien är att klinisk misstanke om sepsis föreligger och att behandlande läkare ordinerar blododling samt intravenös antibiotikabehandling. På alla med misstänkt neonatal sepsis tas ett extra blodprov 0,5-1,0 ml i ett EDTA-rör förutsatt att föräldrarna lämnar informerat samtycke. På de inkluderade vuxna tas ett extra blodprov 7 ml helblod i ett EDTA-rör, för varje par med blododlingsflaskor som tas, efter att patienten själv eller nära anhörig har lämnat sitt informerade samtycke.

---

Medarbetare/Medsökande

Uwe Ewald
Verksamhetschef, Akademiska sjukhuset, Uppsala, avd 95F

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Deltar i planering och utförande av studien.

Patientrekrytering:

Ansvarig för patientrekrytering i Uppsala

Arbetsenhet:

Avdelming 95 F UAS

Per Olcén
Läkare, Laboratoriemedicinska kliniken/Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

Länstillhörighet:

T

Projektledning:

Ansvarig för administration och utförande av laboratorieanalyser vid Klin. Mikrobiol. Kliniken USÖ

Patientrekrytering:

Deltar ej i patientrekrytering.

Arbetsenhet:

Klin Mikrobilog. Laboratoriet USÖ

Kristoffer Strålin
Läkare, Infektionskliniken USÖ

Länstillhörighet:

T

Projektledning:

Deltar i planering och utförande av studien.

Patientrekrytering:

Ansvarig för patientrekrytering vid infektionskliniken USÖ.

Arbetsenhet:

USÖ.

Handledare

Jens Schollin
Läkare, Örebro universitet

Maria Björkqvist
Läkare, Barn o ungdomsklin Universitetssjukhuset Örebro

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2006-10-01

Beräknat projektslut

2009-12-31

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Alla nyfödda barn har ökad benägenhet att drabbas av bakteriella infektioner, för tidigt födda eller barn med vissa andra sjukdomstillstånd är särskilt utsatta. Bakteriell infektion hos nyfödda utvecklas inte sällan till sepsis (”blodförgiftning”). Neonatal sepsis är ett allvarligt tillstånd med betydande mortalitet och morbiditet, det är också ett tillstånd med snabbt förlopp och ospecifika initiala symptom. Neonatal sepsis behandlas med antibiotika och andra intensivvårdsinsatser, vilka har god effekt särskilt om rätt antibiotika sätts in tidigt i förloppet. Det är därför av yttersta vikt att ha tillgång till snabba och exakta diagnosmetoder. Även hos vuxna är sepsis ett ytterst allvarligt tillstånd och patienter med nedsatt immunförsvar delar spädbarnets sjukdomsbild, som kan vara ytterst svårbedömd. Idag används framför allt två metoder för att diagnostisera neonatal sepsis, blododling och inflammatoriska markörer.

Blododling
Blododling är tidskrävande, i klinisk vardag dröjer det minst två dygn innan svar föreligger och antibiotikaresistensbestämning tar ytterligare ett dygn. Metoden brister också i både sensitivitet och specificitet.

Inflammatoriska markörer
När kroppen utsätts för en bakteriell infektion aktiveras immunförsvaret och ett flertal inflammatoriska markörer eller cytokiner frisätts i blodet. Många av dessa går att mäta i blodprov (CRP, IL1-ra IL-6, IL-8 m m) och intensiv forskning pågår för att utröna om någon av dessa kan vara den ideala snabba markören för neonatal sepsis. På svenska sjukhus, inklusive USÖ och UAS, används CRP rutinmässigt i första hand.

Syfte/frågeställning/hypotes

Att med ett prospektivt studieupplägg jämföra realtids-PCR med konventionell blododling vad avser sensitivitet, specificitet samt snabbhet att detektera en bakteremi.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

I denna studie samlar vi blodprover från tre olika enheter, neonatalavdelningarna i Uppsala och Örebro samt från infektionskliniken USÖ. Inklusionskriterie till studien är att behandlande läkare misstänker att sepsis/bakteremi föreligger och ordinerar blododling samt intravenös antibiotikabehandling. På alla barn med misstänkt neonatal sepsis tas ett extra blodprov 0,5-1,0 ml i ett EDTA-rör förutsatt att föräldrarna lämnar sitt informerade samtycke. På alla inkluderade vuxna tas ett extra blodprov 7 ml helblod i ett EDTA-rör, för varje par med blododlingsflaskor som tas, efter att patienten själv eller en nära anhörig har lämnat sitt informerade samtycke. Samtliga blodprov skickas omedelbart till kliniskt mikrobiologiska laboratoriet USÖ där de analyseras med hjälp av realtids-PCR mot 16 S rRNA genen. För vuxenproverna kommer också en jämförande PCR-metod kallad septi-Fast (Roche AB) att användas. Om inte, kommer den att exkluderas. Eftersom septi-Fast kräver 3 ml blod är den inte aktuell att använda på nyfödda då denna mängd blod är orealistiskt att ta. Blodproverna från Uppsala transporteras till USÖ med Jumbolansen vilket gör att de anländer till USÖ kl 16.00 och kan tas om hand direkt. Från patientens journal samlas basala medicinska data som antecknas i ett särskilt formulär.
Om blodprovet innehåller bakterier bildas en PCR produkt som består av mängder med kopior av bakteriens 16 S gen. I realtidsprotokollet ingår även fyra specifika prober, som ger utslag om bakterien är en S. epidermidis, annan koagulas negativ stafylokock, en Stafylococcus aureus eller en Gram negativ bakterie. Genom att se vilken av dessa prober som bundit till amplikonet kan man även få vägledande taxonomisk information. Om realtids-PCR provet utfaller positivt men blododlingen är negativ kommer amplikonet att sekvenseras. Om både blododling och PCR utfaller positivt kommer sekvensering endast att ske om blododlingsresultatet inte stämmer överens med de specifika probernas resultat. Informationen från sekvenseringen jämförs med nukleotidsekvenser registrerade i databaser som finns tillgängliga på internet vid National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) genom ett program som heter BLAST similarity search. Från patientens journal inhämtas data om symtom, CRP värden och blododlingsresultat.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Vi ämnar jämföra realtids-PCR resultaten med blododlingsresultaten både vad gäller snabbhet och exakthet. Såväl sensitivitet, specificitet som negativt och positivt prediktivt värde kommer att beräknas. En svårighet i den statistiska analysen kommer att uppstå eftersom blododling i sig har så stora brister att det inte finns någon ”golden standard” att jämföra med.

Vid vår tidigare studie inkluderades 296 fall varav 51 med positiv blododling. Denna studie gav för låg sensitivitet, 42% (29-57), pga ej optimal provhantering. Vi vill nu studera om vi kan uppnå en sensitivitet på minst 80% med ny och förbättrad provhantering. Vi antar att sensitiviteten med den nya provhanteringen har stigit till 80%. För att då få ett 95% konfidensintervall som inte sträcker sig över 70% måste 100 fall med positiv blododling ingå, dock måste minst 50 av dessa patienter vara neonatalpatienter. Vi räknar med att ca 600 patienter behöver inkluderas för att uppnå dessa siffror.

Studiens genomförande

vg se design och urval.

---

Forskningsetiska överväganden

Det dominerande etiska problemet i denna studie består i att den bedrivs på nyfödda barn och att föräldarna ibland kan komma att tillfrågas i efterhand. Anledningen att nyfödda måste inkluderas är att just dessa patienter lider speciellt stor risk att drabbas av blodförgiftning. För att förbättra diagnostiken för denna patientgrupp kan inte denna forskning bedrivas på annat sätt. Eftersom nyfödda inte själva kan ge sitt informerade samtycke tillfrågas föräldrarna i deras ställe.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

2007-03-21

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

2007/071

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

1. Fenollar F and Raoult D (2004). "Molecular genetic methods for the diagnosis of fastidious microorganisms." APMIS 112(11-12):785-807.

2. Jordan JA and Durso MB (2005). "Real-time polymerase chain reaction for detecting bacterial DNA directly from blood of neonates being evaluated for sepsis." J Mol Diagn 7(5):575-81.

3. Ohlin A, Backman A, Bjorkqvist M, Molling P, Jurstrand M, Schollin J. Real-time PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia. Acta Paediatr 2008;97(10):1376-80.

C Bilagor

Eventuella bilagor som skickas in i pappersformat

Beslut EPN Dnr 2007/71

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

580 235

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

BMA KFC 25% i 4 mån 36272 kr inkl soc avgifter.
Forsknings ssk 10% i 12 mån vid 3 kliniker 120000kr inkl soc avgifter.

Utrustning

DNA-prepareringskostnaderna består i huvudsak av följande:Qiagen kit,
Mutanolysin, Real-PCR TaKaRa, Primers, Prober, Kappilärer (M-Grade) DNA-fria, Rening High Pure kolonn samt rör pipettspetsar m.m

DNAsekvenseringskostnaderna består av följande:
Pyrosekvensering 21875:-
PCR + rening 12000:-
Tippar x 3 2100:-

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Detta projekt utförs på blodprover från sjuka patienter i vårt område. Studien är i allra högsta grad kliniskt patientnära. Frågeställningen som hanterar diagnostik av allvarliga infektioner är mycket central för sjukvården och naturligtvis för den som drabbas. Om vår metod går att applicera i klinisk vardag kommer den genast att underlätta för patienter som snabbare får korrekt behandling. Någon liknande studie inom detta område har inte gjorts tidigare, nationellt eller internationellt.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Sepsis är en sjukdom som kännetecknas av tre besvärande faktorer: Det är en förhållandevis vanlig, allvarlig sjukdom som är svår att diagnostisera, framför allt hos nyfödda och vuxna med sänkt immunförsvar. Detta gör att patienter idag både över och underbehandlas för sepsis, många friska får behandling i onödan pga att det inte finns något instrument för att snabbt utesluta diagnosen. Andra patienter behandlas sent eftersom de initiala tecknen är diskreta och svårtolkade. Forskning som syftar till att förbättra diagnostiken måste därför anses ha allra högsta kliniska betydelse. Ett genombrott inom detta forskningsområde skulle kunna rädda sjuka patienter från död och svåra följdsjukdomar samtidigt som de som inte har sepsis skulle kunna slippa onödiga behandlingar och sjukhusvistelser, vilket även skulle minska kostnader och antibiotikaanvändningen inom sjukvården. Vi tror att denna studie kan bidraga till ett sådant genombrott.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

Projektet inkluderar prover från Uppsala och Örebro län och omfattar både vuxenkliniker och barnkliniker. Detta kommer att leda till att stärka kontakterna mellan de inblandade klinikerna och förenkla samarbetet med dessa. Det kommer också att stärka samarbetet och kontakterna mellan vuxen- och barnkliniker. Det kommer i framtiden att förenkla samarbeten oavsett om dessa är av klinisk eller vetenskaplig karaktär. Den breda basen för studien kommer också att förenkla implementering av resultaten om dessa blir av klinisk betydelse.

Publicering

Projektet kommer att publiceras i formen av 2 artiklar en omfattande barnmaterialet och en omfattande vuxenmaterialet. Vilka vetenskapliga tidsskrifter som kan bli aktuella är inte helt klart förrän resultat föreligger, men barnresultaten planeras att publiceras i Pediatrics.

---

F Vetenskaplig redovisning - gäller endast för fortsättningsansökningar

Rapporteringsläge

Lägesrapport

Rapporteringsdatum

2008-09-30

Publikationer

1. Projektet har ännu inte resultarat i någon publikation.
2.Projektet kommer att publiceras i formen av 2 artiklar en omfattande barnmaterialet och en omfattande vuxenmaterialet. Vilka vetenskapliga tidsskrifter som kan bli aktuella är inte helt klart förrän resultat föreligger, men barnresultaten planeras att publiceras i Pediatrics.
3. Redovisning vid Pediatric Academic Societies årsmöte samt Svenska Perinatalmötet planeras.

Vetenskaplig progress och studiens genomförande

Studien förlöper enligt planerna, provinsamlingen inleddes 071001 på infektionskliniken USÖ, Avdeling 95F UAS och Avdelning 35 USÖ. Sepi-Fast har utvärderats och används på vuxenproverna. Provinsamlingen av vuxenprover har gått utan problem och avbryts 080930 då den har pågått i exakt 1 år.
Samtliga vuxenprover analyseras fortlöpande med Septi-fast vid Kliniskt mikrobiologiska laboratoriet USÖ, och den utvecklade Real-Tids PCRn används på samtliga prover som är positiva i blododling samt matchade kontroller.

I barnstudien hade 219 prov samlats i 080901, vilket är en högre insamlingstakt än förväntat.PCRn utförs fortlöpande och resultaten jämförs med odlingsresultat från de mikrobilogiska laboratorierna vid USÖ resp UAS. Studieplanen var att provinsamlingen skulle pågå i ca 2 år dvs tom 091001, men om den höga insamlingstakten fortsätter kan studien komma att brytas tidigare.

Den föregående studien som är bakgrunden till denna studiens genomförande är nu publicerad i Acta Pediatrica.

Resultat

En första analys av barnproverna gjordes när de 61 första proverna hade samlats in. Resultaten såg ut enligt följande:

Odling
PositivNegativTotal
PCRPositiv8715
Negativ04646
Total85361

-Sensitivitet 8/8 = 100%
-Specificitet 46/53 = 87%
-Pos Predictive Value 8/15 = 53%
-Neg Predictive Value = 46/46 100%

Således mycket positiva preliminära resultat även om de måste anses som mycket osäkra eftersom de baserar sig på ett fåtal prover.

Ekonomisk redovisning

Samtliga medel som hittills har beviljats har använts till prov hantering och provanalyser,de har alltså varit helt nödvändiga för det vetenskapliga resultatet och det regionala samarbetet.Medlen är förbrukade enligt följande:
DNA preparerings kit (Qiagen): 12610 kr
Reagenser (Gbgs termometerfabrik): 81240 kr
Primers (Applied Biosystems): 16607 kr
Enzym (Mutanolyzin Sigma Aldrich) 4593 kr
Lab personal: 82 500 kr
Summa 202143 kr

Planerad spridning och implementering

Förrutom den planerade publiceringen i vetenskapliga tidsskrifter kommer resultaten att presenteras vid Pediatric Academic Societies årsmöte samt Svenska Perinatalmötet. Vidare kommer lokala informationsmöten vid de inblandade klinikerna att hållas. Om metoden visar sig kliniskt användbar kommer vi sträva efter att metoden tas upp som rutinmetod vid i första hand de mikrobiologiska laboratorierna i både Uppsala och Örebromen därefter verka för en större spridning både inom och utom regionen.