Gravestoxikos och postoperativ ”bone hunger” och hypokalcemi samt analys av paratyroideakörtlarnas immunologiska status
Diarienummer : RFR-31621
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Per Hellman, 2008-09-26
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Professor
Arbetsplats vid ansökningstillfället : Institutionen för kirurgiska vetenskaper, Uppsala universitet
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2009-02-27
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Per Hellman
Läkare, Institutionen för kirurgiska vetenskaper, Uppsala universitet

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

Sammanfattning

Graves toxikos är en vanlig sjukdom som drabbar ca 2% av alla kvinnor. En vanlig följd av sjukdomen är osteoporos pga den höga benomsättningen som uppstår. Mekanismerna bakom denna är inte klarlagd, flera olika hypoteser föreligger. Efter tyroideakirurgi för Graves toxikos uppkommer inte sällan låga kalkvärden, vilket också kan ha flera olika orsaker - försämrad paratyroideafunktion efter halskirurgin - autoimmuna effekter som aktiveras postoperativt - nedsatta vitamin D nivåer eller nedsatt vitamin D känslighet pga resistent vitamin D receptor (VDR) - ett "skelettsug" (bone hunger) som leder till att skelettet ökar sitt upptag av kalcium med hypokalcemi i blodet som följd.

Målet med den aktuella studien är att kartlägga kalkmetabolismen hos patienter som lider av Graves toxicos och som opereras med total tyroidektomi. Dessutom planeras att studera interaktion mellan tyroidea, Graves-patienters autoimmuna serum och paratyroidea i avsikt att finna faktorer (autoantikroppar t.ex) som uppkommit och som också påverkar paratyroidea. Konsekutiva patienter som ska opereras för Graves toxikos får frågan om deltagande i studie, varefter de genomgår bentäthetsmätning (DEXA) samt en särskild belastning där citrat resp kalcium infunderas i sekvenser , s.k. cica-klamp, i avsikt att studera relationen mellan kalcium och PTH, och därmed paratyroideas funktion. Undersökningarna görs före och efter operation. Vitamin D-nivåer i serum och vilken polymorf typ av VDR varje individ har analyseras. Serum från patienter med Graves toxikos används för att inkubera odlade paratyroideaceller. Immunprecipitering av patientsera mot paratyroideaextrakt genomförs i avsikt att finna immunotargets på paratyroidea. Proteiner ingående i immunsystemet (t.ex CD4) finns uttryckt på paratyroideacellens yta, vilket tas i beaktande.

Studien torde kunna belysa oklarheter angående den skelettrubbning vid Gravestoxikos som föreligger idag, och samtidigt klargöra immunologiska mekanismer som kan interagera med fr.a. paratyroideacellernas funktion vid Graves toxikos, men också i andra sammanhang.

---

Medarbetare/Medsökande

Maria Annerbo
Läkare, Kirurgkliniken, Falu lasarett

Länstillhörighet:

W och Uppsala Universitet

Projektledning:

Deltar i uppläggning av projektet. Kommer att handledas av Per Hellman, Uppsala. Beräknar ansöka om antagning som doktorand.

Patientrekrytering:

Deltar aktivt i rekrytering av patienter.

Arbetsenhet:

Falu lasarett

Peter Stålberg
Läkare, Kirurgkliniken, Akademiska Sjukhuset

Länstillhörighet:

C, Uppsala universitet

Projektledning:

Deltar i projektledning

Patientrekrytering:

Aktiv i patientrekrytering

Arbetsenhet:

Akademiska Sjukhuset, Inst. för Kirurgiska Vetenskaper

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2008-12-01

Beräknat projektslut

2012-12-31

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Bakgrund

Graves toxikos är en vanlig sjukdom som drabbar ca 2% av alla kvinnor (10 x vanligare än hos män), med peakinsjuknande i 20-50 årsåldern. En genetisk predisposition underlättar insjuknande i denna autoimmuna sjukdom, där utlösande mekanismer inkluderar högt jodintag, stress och tiden efter graviditet. Tyroideastimulerande antikroppar som binder till TSH (tyroideastimulerande hormon)-receptorn (TRAK) kan uppmätas och är diagnostiskt. Vid Gravestoxikos uppkommer en mängd symtom, där en av de mindre uppmärksammade, men likväl på lång sikt synnerligen viktigt, en urkalkning av skelettet (ökar skelettets ”turnover”) på grund av den höga ämnesomsättningen. Mekanismerna är inte helt klarlgada, och flera delfrklaringar finns: Tyroideahormonerna T3 och T4 stimulerar benomsättningen vilket resulterar i en ökad nedbrytning samtidigt som en försämrad uppbyggnad - TSH kan fungera som en negativ regulator på bone turnover som binder via TSH-receptorn på både osteoblaster och osteoclaster. För låga halter av TSH kan delvis vara förklaringen till den urkalkning av skelettet som ses vid Graves toxicos. De tyroideareceptor stimulerande antikropparna TRAK kan också binda till TSH-receptorer i skelettet och leda till negativa effekter. Urkalkningen leder till osteoporos och en ökad risk för frakturer, vilket är särskilt negativt för kvinnor som i menopaus ändå drabbas av osteoporos i hög frekvens.

Graves toxicos behandlas ofta genom operation; total tyroidektomi eller near total tyroidektomi. Postoperativt botas de flesta patienter och återfår en normal benomsättning. En iakttagelse vi och andra gjort är dock att en del av patienterna får påtaglig postoperativ hypokalcemi, till en grad som överstiger den som andra patienter som genomgår samma operation pga av andra diagnoser (t.ex struma eller tyroideacancer). Temporär postoperativ hypokalcemi är dock en relativt vanlig komplikation efter tyroidektomi. Det kan bero på att paratyroideakörtlarna har blivit skadade, devaskulariserade eller ”inadvertent removed” under operationen, vilket är den mest utbredda uppfattningen idag. Mycket tyder dock på att det finns andra orsaker till den postoperativa hypokalcemin, t.ex ”hungry bone syndrome” eller idag okända immunologiska mekanismer. Det urkalkade skelettet börjar direkt sin återuppbyggnad och tar upp mycket kalk från cirkulationen vilket resulterar i en grav hypokalcemi hos patienten. I praktiken verkar det som att en patient som är dåligt inställd på mediciner preoperativt utvecklar kraftigare hypokalcemi postoperativt.

En studie från Singapore (See & Soo 1997) visar att av 51 opererade tyreotoxiska patienter hade ingen hypoparatyroid funktion postoperativt men incidensen av biokemisk hypokalcemi var 53 %. En annan studie klargör ett nyupptäckt ytprotein på paratyroideacellens yta (NALP5) som målprotein för autoantikroppar vid Autoimmunt polyendokrint syndrom typ 1 (APS-1) där hypoparatyroidism kan ingå (Alimohammadi NEJM 2008). Paratyroideacellen uttrycker en rad immunologiska proteiner, såväl normala som patologiska paratyroideaceller uttrycker T-lymfocytproteinerna CD3 och CD4 och antikroppar riktade mot dessa proteiner påverkar paratyroideacellens funktion (Hellman et al 1995, 1996). I patologiska paratyroideaceller uppkommer ett uttryck av HLA class II antigen, talande för hittills okända immunologiska mekanismer som kan påverka paratyroideacellerna (Bjerneroth. Vidare har Graves toxikos-patienter påvisats kunna ha lägre halter av vitamin D, möjligen beroende på nedpressat PTH sekundärt till den hyperkalcemi som kan uppstå som följd av den ökade skelettomsättningen, men mekanismerna är ofullständigt klarlagda. Ovanstående uppräkning av tänkbara mekanismer innebär att orsaken till den postoperativa hypokalcemin kan vara multifaktoriell, inte bara beroende på rent kirurgisk påverkan, men också att hittills okända immunologiska mekanismer kan påverka paratyroideacellernas proliferation såväl som funktion. Med utgångspunkt av det autoimmuna tillståndet Grave's toxikos kommer dessa frågor att belysas.

Syfte/frågeställning/hypotes

Målet med studien är att kartlägga kalkmetabolismen hos patienter som lider av Graves toxicos och som opereras med total tyroidektomi. Dessutom planeras att studera interaktion mellan tyroidea, Graves-patienters autoimmuna serum och paratyroidea i avsikt att finna faktorer (autoantikroppar t.ex) som uppkommit och som också påverkar paratyroidea. Frågeställningar/hypoteser inkluderar: Finns korrelation mellan preoperativ skelettpåverkan, svårighetsgrad av Graves toxikos och grad av postoperativ hypokalcemi? Är set-point mellan kalcium och PTH vänsterförskjuten preoperativt? Finns serumfaktor som identifierar och eventuellt påverkar paratyroideacellernas funktion hos Graves patienter? Har Graves-patienter lägre vitamin D-nivåer än normalt? Är deras polymorfismuppsättning av vitamin D receptorn (VDR) av samma typ som den hos patienter med hyperparatyroidism och osteoporos? Kan paratyroideas funktion påverkas av immunologiska faktorer?

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

Studien inleds med att konsekutiva patienter som ska opereras för Graves toxikos får frågan om deltagande i studie. De genomgår därefter bentäthetsmätning (DXA) samt en särskild belastning där citrat resp kalcium infunderas i sekvenser , s.k. cica-klamp, i avsikt att studera relationen mellan kalcium och PTH, och därmed paratyroideas funktion. Denna metod har använts för studier av patienter med hyperparatyroidism (HPT), vilka har en högerförskjuten relation mellan kalcium och PTH, och därmed en högerförskjuten set-point (den kalciumkoncentration som innebär 50% hämning av maximal PTH sekretion). Cica-klamp görs före, om möjligt cirka dag 2 postop och 6 -12 månader postop. En av våra hypoteser är att denna relation rubbas vid Gravestoxikos och normaliseras efter kirurgisk bot (se ovan). Vitamin D i serum analyseras också, liksom patienternas typ av VDR polymorfism, sistnämnda genom PCR av DNA erhållet från blodprov följt av restriktionsenzymklyvning enligt välkänt protokoll. En viss uppsättning av polymorfismer i VDR innebär lägre uttryck av VDR i paratyroideacellen och därmed sämre hämning av cirkulerande vitamin D. Patientsera används för att inkubera odlade paratyroideaceller, vilka kan vara bovina eller humana erhållna från patienter opererade för HPT. Vid denna inkubation studeras påverkan på PTH sekretion, kalciumkänslighet och cellproliferation. Kalciumkänslighet studeras genom inkubation av cellerna i olika kalciumkoncentrationer och analys av PTH sekretionen. Dessutom utförs immunprecipitering av paratyroideaproteinextrakt med sera i avsikt att finna faktorer som identifierar paratyroideastrukturer, där flera tänkbara finns: NALP5 (Alimohammadi 2008), kalciumreceptorn (CaR; Brown et al), megalin (Juhlin et al, Hjälm et al), VDR, CD3, CD4 eller enzymer ingående i vitamin D-aktiveringen, 1-alfa-hydroxylas, 24-hydroxylas och 25-hydroxylas (Segersten et al).
Vi planerar att i första hand undersöka 30 patienter, detta antal framräknat efter en poweranalys där vi önskat 20% skillnad mot frisk individ med 95%-igt konfidensintervall och 80% power.

Redovisning av interventionen

Interventionen i denna studie kan eventuellt hänföras till den s.k. CICA-klamp som planeras. Detta genomförs på klin. kem lab, där patienten erhåller en nål i vardera armen, där sekvensiellt citrat följt av kalcium infunderas i ena armen, och blodprover tas med jämna mellanrum i den andra armen. Man kan påverka nivån av joniserat kalcium med denna metod, och se hur paratyroideacellrna reagerar på detta. Metoden innebär uträknande av en set-point (se ovan), och är reproducerbar och känslig (Schwarz et al).

Metod och datainsamling/ -bearbetning

30 konsekutiva patienter genomgår CICA-klamp (se ovan), och DEXA-mätning för analys av bentäthet. Analys av basala värden för kalcium PTH, fosfat, 25-OH-vitamin D3 och 1,25-dihydroxy vitamin D3 görs. DNA prepareras från helblod, och via PCR amplifieras delar av VDR genen där kända polymorfismer finns. Igenkännande av typ av polymorfism görs genom restriktionsenzymklyvning för analys av 4 olika sites i VDR. Patientserum används fr att inkubera paratyroideaceller med. Dessa har erhållits från patienter som opereras för hyperparatyroidism, vars patologiska körtlar dispergerats med kollagenas för att erhålla en cellsuspension. Cellerna sås ut i odlingsskålar och inkuberas med serum, varefter PTH sekretionen analyseras genom att mäta halten PTH med en immunoradiometrisk assay, och cellproliferationen genom dels klassisk cellräkning och analys av Ki67-positiva celler efter immunofärgning. Paratyroideaextrakt som framställs inkuberas med patientsera varvid precipiterade komplex framrenas och separeras på gel. Eventuellt påträffade proteiner som igenkänns av patientsera analyseras. Immunhistokemisk färgning av paratyroideakörtlar med användande av patientsera görs också i avsikt att finna proteiner som reagerar. Genom parallellfärgning kan tänkbara kända målproteiner möjligen upptäckas (megalin, CaR etc., se ovan).
Datainsamling sker genom at införa resultat i en databas, vilken används för statistik bearbetning i avsikt att finna signifikanta skillnader mellan Gravespatienter före och efter kirurgi, men också jämfört med normalpopulationen. Mekanistisk påverkan på paratyroideacellerna klargörs genom upprepade laborativa experiment och statistik bearbetning.

Studiens genomförande

Studien genomförs genom att patienter med Gravestoxikos tilfrågas i Falun (på lasarettets öppenvårdsmottagning) och i Uppsala. Cica-klamp, DEXAmätning och serumanalyser görs på bägge ställena, medan de laborativa experimenten sker på den kliniska forskningsavdelningen vid Akademiska Sjukhuset i Uppsala. Maria Lång planerar att framöver tillfälligtvis vistas där för att genomföra dessa experiment under handledning. Patienterna har skrivit under samtycke att delta i studien, som har granskats av etikprövningsnämnden. I skrivande stund är ansökan inskickad men ännu inte handlagd av EPN. Detta innebär att alla patientdata kommer att handhas konfidentiellt i inlåsta skåp, ej liggande på dataservrar utan på flyttbara minnesmedia, och dessutom avkodade för att förhindra identifikation.

---

Forskningsetiska överväganden

Förhållandet mellan nyttan av att klargöra mekanismer och grad av skelettpåverkan vid Graves toxikos och associerade immunologiska mekanismer som kan påverka paratyroideacellens funktion och den risk som de patienter som accepterar att vara försökspersoner utsätts för måste anses vara relativt sett liten. En Cica-klamp är en procedur som innebär ytterst små risker. Samtliga experiment, inklusive laborativa avkodas för integritetens skull.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

2008-12-17

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

2008/275

Godkännande från etikprövningsnämnd krävs efter beslut för utbetalning av medel

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

Alimohammadi et al. N Engl J Med. 2008 Mar 6;358(10):1018-28. 2008
Basset et al, Mol Endocrinol. 2007 May;21(5):1095-107.
Bjerneroth et al, Surgery. 1998 Sep;124(3):503-9.
Brown EM, Subcell Biochem. 2007;45:139-67. Review.
Carling et al, Nat Med. 1995 Dec;1(12):1309-11.
Galliford et al, Minerva Endocrinol. 2005 Dec;30(4):237-46.
Hellman et al. Surgery. 1995 Dec;118(6):1055-61.
Hellman et al, Surgery. 1996 Dec;120(6):985-92.
Hjälm et al, Eur J Biochem. 1996 Jul 1;239(1):132-7.
Juhlin et al,J Biol Chem. 1990 May 15;265(14):8275-9.
Schwarz et al, Eur J Clin Invest. 1993 Sep;23(9):546-53.
See & Soo, Br J Surg. 1997 Jan;84(1):95-7.
Segersten et al, J Clin Endocrinol Metab. 2002 Jun;87(6):2967-72.

C Bilagor

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

1 875 000

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

Avser tid för Maria Lång att kunna heltid och koncentrerat i perioder ägna sig åt föreliggande forsknignsprojekt (200 000), men också för forskningssköterska och avlöning av laboratoriepersonal för att kunna genomföra projektet (100 000).

Medicinsk service

Kostnad till klin. kem lab fr Cica-klamp, kostnad för serumanalyser av kalcium. PTH, fosfat, vitamin D + kostnad för DEXA-mätningar

Utrustning

inköp av odlingsskålar, odlingsmedium, div kemikalier fr de laborativa analyserna samt en frys fr förvaring av proverna

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Projektet får anses vara synnerligen patientnära, då de kommer att mta inblandade personer ett flertal gånger under processen, och resultaten direkt kan korreleras till patientens sjukdom.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Kliniska betydelsen får anses vara stor - förståelsen och eventuell behandling av nedsatt bentäthet är en direkt följd, och upptäckt av hittills okända eventuellt immunologiska faktorer som påverkar paratyroideacellens funktion leder till möjlighet att förebygga hypokalcemi efter operation för Graves toxikos, men öppnar också nya möjligheter att behandla paratyroideasjukdomar framöver.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

Det regionala samarbetet Falun-Uppsala får anses vara optimalt. Dels finns redan tydliga kanaler upparbetade mellan sjukhusen och länen, och inte sällan diskuteras gemensamma patientkategorier kollegor emellan, inte minst patienter med Graves toxikos. Att kollegor på bägge ställen nu samarbetar om ett projekt kring detta fördjupar samarbetsklimatet. Vi kommer också använda de faktorer som resp. sjukhus/län är bra på - i Dalarna finns en stor andel patienter med Graves toxikos, en långvarig tradition och tydligt intresse att hantera dessa patienter och i Uppsala finns laborativa resurser att utföra mer djupgående molekylärbiologiska och cellbiologiska analyser med.

Publicering

Resultaten kommer att skickas in till referee-granskade tidskrifter för publicering, och förhoppningsvis ingå i avhandlingsarbete.

---