Antiangiogena substansers betydelse vid koloncancer
Diarienummer : RFR-31571
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Peter Åkerud, 2008-09-25
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Läkare, Medicine Doktor (MD, PhD)
Arbetsplats vid ansökningstillfället : kirurgkliniken, UAS
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2009-03-23
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Peter Åkerud
Läkare, kirurgkliniken, UAS

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

Sammanfattning

Angiogenes, bildandet av nya blodkärl, pågår kontinuerligt i en mängd fysiologiska processer och även vid tillväxt av tumörer. Observationen att primärtumörer kan frisätta antiangiogena substanser som hämmar tillväxt av tumörmetastaser föranledde identifiering av de första antiangiogena substanserna. Idag finns ca 30 antiangiogena substanser identifierade. Det är visat i en mängd djurstudier och även i enstaka studier hos människa att administrering av antiangiogena substanser kan hämma tumörtillväxt.
Denna studie syftar till att kartlägga regleringen av endogena nivåer vid koloncancer i plasma, urin och cancervävnad för några av de senare identifierade antiangiogena substanserna, bl.a. Histidine-rich Glykoprotein (HRGP), Trombospondin (TSP) och vissa former av Antitrombin (AT). Merparten av dessa är även involverade koagulationsprocessen. Dessa substanser har ej undersökts tidigare vid koloncancer. Ökade kunskaper om denna reglering skulle kunna bidra till utvecklandet av diagnostiska metoder för koloncancer och i förlängningen även nya behandlingsmetoder involverande antiangiogena substanser.

---

Medarbetare/Medsökande

Per Hede
Läkare, Kirurgkliniken, CSK

Länstillhörighet:

Värmland (S)

Projektledning:

Delaktig i projektledningen.

Patientrekrytering:

Ansvarar för insamlandet av patientmaterial kirurgkliniken, Centralsjukhuset Karlstad.

Arbetsenhet:

Kirurgkliniken, Centralsjukhuset Karlstad.

Thomas Hallgren
Läkare, Kirurgkliniken, Centralsjukhuset

Länstillhörighet:

Värmland (S)

Projektledning:

Delaktig i projektledning och övergripande forskningshandledning kirurgkliniken, Centralsjukhuset Karlstad.

Patientrekrytering:

Delaktig i insamlandet av patientmaterial kirurgliniken, Centralsjukhuset Karstad.

Arbetsenhet:

Kirurgkliniken, Centralsjukhuset Karlstad.

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2007-05-01

Beräknat projektslut

2010-04-30

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Angiogenes, bildandet av nya blodkärl, pågår kontinuerligt i en mängd fysiologiska processer och även vid tillväxt av tumörer. Allt fler observationer visar att hämning av angiogenes kan motverka och förhindra tumörtillväxt.

Observationen att vissa primärtumörer frisätter en substans som hämmar tillväxt av dess metastaser föranledde identifieringen av de antiangiogena substanserna angiostatin (1) och endostatin (2). Förhöjda nivåer både i plasma och urin sågs. Administrering av dessa substanser i olika tumörmodeller har visat bra behandlingseffekt med liten eller ingen risk för resistensutveckling och inga eller små biverkningar jämfört med konventionella cytostatika. Det har även gjorts studier med kombinationsbehandling med angiogeneshämmare och cytostatika, alternativt strålbehandling där man ser en additiv effekt (3,4).

I dagsläget har ett trettiotal antiangiogena substanser identifierats. De har studerats i varierande grad, framför allt i olika djurmodeller, där god effekt med avseende på hämning av tumörtillväxt setts (5). En stor mängd kliniska studier pågår och några angiogeneshämmare har blivit godkända läkemedel, varav de flesta hämmar den angiogena substansen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (t.ex. Avastin i Sverige).

Några hos männska mindre väl studerade antiangiogena faktorer är Histidine-rich Glycoprotein (HRGP), Trombospondin (TSP) samt latent och prelatent antitrombin (latent AT och prelatent AT). Dessa substanser har visat kraftig antiangiogen effekt både in vitro och in vivo. I djurstudier har en kraftigt hämmad tumörtillväxt efter administrering av dessa ämnen setts (6,7,8).

HRGP är ett heparinbindande glykoprotein som syntetiseras och frisätts fr.a. från levern. Plasmanivåerna ligger normalt runt 1,5 umol/L. HRGP verkar som ett negativt akut fasreaktantprotein och minskar markant vid icke specifik vävnadsskada (9). Vidare har höga plasmanivåer kopplats till tromboemboliska tillstånd (10). HRGP är involverat i en rad biologiska processer fr.a. inom angiogenes och koagulation. Det kan klyvas endogent i mindre fragment och sekvenser av den histidin-prolinrika regionen (H/P domänen) förmedlar den antiangiogena effekten (11,6). Det har visats att bindning av protein sker fr.a. vid låga pH-värden och höga Zn²+-nivåer som föreligger bl.a. i områden med inflammation och i tumörer.

Trombospondin-1 (TSP-1) är ett glycoprotein med potent antiangiogen aktivitet som föreligger i alpha-granula hos trombocyter och frisätts vid trombcytaktivering. Det frisätts även från endotelceller och glatta muskelceller i kärl (12).

Antitrombin (AT) är ett heparinbindande plasmaprotein. I sin grundform är det en viktig koagulationshämmande faktor men har även visat antiinflammatoriska och antiangiogena egenskaper. Latent och prelatent AT är båda partiellt denaturerade former av AT. Både latent och prelatent AT hämmar angiogenes och carcinogenes in vitro och i djurstudier i högre grad än nativt AT (7,8). Latent AT har låg heparinbindande förmåga och hämmar inte koagulation medan prelatent AT binder heparin och hämmar koagulation i motsvarande grad som nativt AT.

Ökad kunskap om den endogena regleringen av antiangogena substanser i plasma, urin och tumörvävnad skulle kunna bidra till utveckling av nya diagnostiska och prognostiska markörer vid koloncancer. I förlängningen skulle det även kunna bidra till utvecklingen av nya behandlingsmetoder vilket skulle förbättra resultat och prognos för dessa patienter.

Syfte/frågeställning/hypotes

Syftet med studien är att uppnå en bättre kunskap om fysiologin vid tillväxt av kolontumörer och hur nivåer av antiangiogena substanser reagerar på patologiska tillstånd som tumörtillväxt.

Delmål 1: Studera antiangiogena substansers förekomst och nivåer i kolontumörer.

Delmål 2: Studera nivåer av antiangiogena substanser i plasma och urin hos koloncancerpatienter för att se om det går att korrelera nivåskillnader till olika tumörstorlekar och tumörstadier.

Delmål 3: Jämföra förekomst av antiangiogena substanser i perifer venös plasma med plasma taget från det venösa avflödet från det tumörinnehållande tarmsegmentet för att se om det sker en frisättning, alternativt konsumtion av antiangiogena faktorer från tumören.

Hypotes delmål 1: Att man kan se ökade, alternativt minskade nivåer av antiangiogena substanser vid olika tumörstatdier av koloncancer. Påvisbara skillnader i vävnad vid olika tumörstadier och differentieringsgrad skulle kunna bidra till utveckling av progniostiska markörer för koloncancer.

Hypotes delmål 2: Att det föreligger en nivåskillnad av antiangiogena faktorer i plasma och urin hos friska jämfört med sjuka patienter och att nivåskillnaderna ökar vid mer avancerade stadier av cancersjukdom (fr.a. ökad tumörbörda men även differentieringsgrad). Påvisbara skillnader skulle kunna bidra till utveckling av diagnostiska och prognostska markörer för tidigare upptäckt av sjukdom och bättre behandling.

Hypotes delmål 3: Att tumören frisätter, alternativt konsumerar antiangiogena substanser. Förutom ökad förståelse för fysiologin skulle kunna det ge en vägledning hurvida behandling med respektive antiangiogen substans skulle kunna vara effektiv eller ej.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

Patienter planerade för operation av koloncancer kommer att inkluderas. Som kontrollgrupp kommer patienter planerade för benign kolonkirurgi, fr.a. divertikulospatienter att inkluderas. Efter diagnos, i samband med beslut om operation får patienten muntlig och skriftlig information angående studien (V.g. se bifogad patientinformationslapp). De tillfrågas om de kan tänka sig att ingå i studien. Informerat samtycke inhämtas. Från patient- och journaldata inhämtas för studien i övrigt relevant information. Ett studieprotokoll bifogas journalhandlingarna och följer patienten under hela studien. Insamlat material läggs in avidentifierat i SPSS för fortsatt analys.

I första hand kommer nivåer av antiangiogena substanser i plasma och urin att jämforas mellan koloncancerpatienter och "friska" kontroller planerade för benign kolonkirurgi. En jämförelse kommer även att göras vad gäller nivåer av antiangiogena substanser vid olika stadier av koloncancer och olika differentieringsgrad. Nivåbestämning av antiangiogena substanser i vävnad kommer också att göras vid olika tumördifferentieringsgrad. Då dessa faktorer inte studerats tidigare i detta samanhang går det ej på förhand att utföra någon egentlig powerberäkning. Liknande upplägg tidigare visar dock att det är rimligt med grupper på 25-30 individer vilket innebär ca 25-30 kontrollpatienter och ca 100-120 koloncancerpatienter (fyra tumörstadier) totalt.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Preoperativt, helst i samband med den sedvanliga rutinblodprovstagningen, tas två extra blodprov och ett urinprov. Plasma och serum utvinns ur blodproven. Plasma, serum och urinprov förvaras därefter i -70ºC för framtida analys. Vid sedvanliga uppföljningen ca en månad postoperativt sker samma förfarande för att kunna jämföra nivåskillnader pre- och postoperativt.

Peroperativt planeras det även att ta venprov från kärl som dränerar tumören och i anslutning till detta jämförande perifert venöst blodprov för att se om det frisätts, alternativt konsumeras antiangiogena substanser av cancertumören. Dessa behandlas på samma sätt som ovan för framtida analys. I lämpliga fall sparas en liten bit tumörvävnad som fryses på torris och förvaras i -70ºC för framtida nivåbestämning av antiangiogena substaser.

Rutinmässigt skickas cancerpreparat för histologisk analys på patologen. I dessa preparat kan det bli akuellt att analysera kärltäthet och lokalisation och uttryck av antangiogena substanser. För nivåbestämning i plasma, urin och vävnad kommer i första hand ELISA och eventuellt Western-blot att användas. Vid analys av histologska snitt kommer i första hand immunohistokemi och ev. in situ hybridisering (oligo, alt riboprober) att användas.
Från patient- och journaldata inhämtas för studien i övrigt relevant information. Av intresse bl.a. ålder, övriga sjukdomar och läkemedel. Analys av allmänkemikaraktär (blodstatus, elstatus, leverstatus och inflammationsparametrar) utförs på tagna blodprover.

Analys av antiangiogena respektive angiogena substanser i sparad plasma, serum och urin utförs i samarbete med Institutionen för klinisk kemi, Uppsala Akademiska sjukhus. Följande antiangiogena substanser kommer att analyseras: Histidine-rich glycoprotein (HRGP), Trombospondin-1 (TSP-1) och latent och prelatent antitrombin (AT). Nivåer av de angiogena substanserna Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF) och Platelet-derived Growth Factor (PDGF) kommer dessutom att mätas.

Insamlade data lagras som en SPSS fil. Statistisk bearbetning och analys, för att svara på givna frågeställningar, kommer att utföras med hjälp från en statistiker.

Studiens genomförande

Studien är påbörjad och redan väl förankrad på kirurgkliniken, Centralsjukhuset i Karlstad (CSK) vad gäller insamlandet av patientmaterial (plasma, serum, urin och tumörvävnad). Uppskattningsvis hälften av det antal patienter som behövs är redan inkluderade. Godkänd etikansökan finns och patienterna får muntlig och skriftlig information (V.g. se bifogad patientinformationslapp och samtyckesblankett) av inskrivande kirurg innan de väljer att delta. Eventuellt kommer insamlande av patientmaterial påbörjas även på kolorektalsektionen, vo kirurgi, Uppsala Akademiska sjukhus där undertecknad arbetar. Rutinkemiprover analyseras omgående på Institutionen för klinisk kemi, CSK och övrigt insamlat material avidentifieras och förvaras i inrättad biobank FoU Värmland, kirurgkliniken.

Analys av insamlat material kommer att ske bl.a. på Institutionen för klinisk kemi, Uppsala Akademiska sjukhus. Institutionen för Medicinsk Biokemi och Mikrobiologi, Biomedicinskt Centrum, Uppsala tillhandahåller en del nödvändiga antikroppar för analyserna och en del av analyserna kommer att ske där. Undertecknad är delaktig i handhavande av prover, utförande av analyser och datakontroll. Initialt sätts det nu upp en ELISA för HRGP analys i plasma och serum på ovanstående institutioner. Det är tänkt att en pilotanalys på del av redan insamlat materiel kommer att ske senare i höst.

---

Forskningsetiska överväganden

Så fullständig information som möjligt till patienten innan de väljer att gå med eller ej. Små risker för patienterna men venös blodprovstaging och lämnande av urinprov. Även minsta möjliga insats från patientens sida i samband med provtagning då det samordnas med rutinprovtagning inför den behandling och uppföljning de har för grundsjukdomen i fråga.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

2007-02-07

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

Dnr 2007/005

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

1) M.S. O’Reilly et. al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the supression of metastases of a Lewis lung carcinoma, Cell 79 (1994) 315-328.
2) M.S. O’Reilly et. al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth, Cell 88 (1997) 277-285.
3) D. Abraham et. al. Low dose carboplatin combined with angiostatic agents prevents metastasis in human testicular germ cell tumor xenografts, J. Urol. 170 (2003) 1388-1393.
4) X. Luo et. al. Enhancement of radiation effects by pXLG-mEndo in a lung carcinoma model, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2005).
5) Folkman J. Antiangiogenesis in cancer therapy-endostatin and its mechanisms of action, Exp. Cell. Res. 312 (2006) 594-607.
6) Olsson AK et. al. A fragment of histidine-rich glycoprotein is a potent inhibitor of tumor vascularisation, Cancer Res. 64 (2004) 599-605.
7) Larsson H et. al. Anti-angiogenic effects of latent antithrombin through perturbed cell-matrix interactions and apoptosis of endothelial cells, Cancer Res. 60 (2000) 6723-6729.
8) Larsson H et. al. A novel anti-angiogenic form of antithrombin with retained proteinase-binding ability and heparin affinity, J. Biol. Chem. 276(15) (2001) 11996-12002.
9) Saigo K et. al. Histidine-rich glycoprotein as a negative acute phase reactant, Am. J. Hematol. 34 (1990) 149-150.
10) Engesser L et. al. Familial elevation of plasma histidine-rich glycoprotein in a family with thrombophilia, Br. J. Haematol. 67 (1987) 355-358.
11) Smith A et. al. Proteolysis of histidine-rich glycoprotein in plasma and in patients undergoing thrombolytic therapy, Thromb. Res. 40 (1985) 653-661.
12) Tolsma SS et. al. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenetic activity, J. Cell. Biol. 122 (1993) 497-511.

C Bilagor

Bilagor

Patientinformation5.doc

Patientinformation och samtyckesblankett
Filstorlek: 32 kB

EPN1.jpg

EPN sid 1

Filstorlek: 218 kB

EPN2.jpg

EPN sid 2

Filstorlek: 150 kB

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

676 000

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

Peter Åkerud- 4 veckor forskning under 2009 inkl sociala avgifter 69000 kr
Per Hede- 4 veckor forskning under 2009 inkl sociala avgifter 69000 kr
Lönemedel assisterande personal 6 veckor under 2009 50000 kr

Medicinsk service

För laborativa analyser av antiangiogena faktorer i serum, plasma och urin behövs antikroppar för att kunna köra ELISA. Inköp av dessa antikroppar motsvaras av: Primär antikroppar 5 st x 5000 kr/st = 25000 kr och sekundär antikroppar 5 st x 5000 kr/st 25000 kr.
För immunhistokemiska analyser på tumörvävnad samt in situ hybridisering (alt. RPA, RT-PCR) behövs diverse kemikalier, primers, prober och annat material för laborativt arbete motsvarande en kostnad på 30000 kr.

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Identifiering av tillförlitliga tumörmarkörer i blod eller urin skulle kunna underlätta screening för koloncancer i syfte att hitta tumörer på ett tidigare stadium (innan symtomdebut). Det innebär större möjighet till bot. Det minimerar även de för patienten mindre behagliga screeningmetoderna (vid symtom) som är gängse idag (koloskopi, kolonröntgen eller CT-kolon).

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Bättre kartläggning och förståelse för angiogena/antiangiogena processer i samband med tumörtillväxt skulle kunna leda till utveckling av mer tillförlitliga diagnostiska och/eller prognostiska tumörmarkörer i kliniken. Studien skulle i förlängningen även kunna bidra till utvecklingen av antiangiogena substanser för behandling av koloncancer och även andra cancerformer.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

Då P Åkerud arbetade som läkare i Karlstad initierades nuvarande projekt. Under den perioden visade kirurgkliniken upp en forskningsvänlig inställning. Det är tydligt att ett flertal av läkarna och övrig personal inom kirurgkliniken är intresserade av forskning, däribland medarbetarna i projektansökan (P Hede och T Hallgren). Under denna tid etablerades även kontakt med Uppsala, bl.a. Institutionen för Klinisk Kemi (Anders Larsson) och Institutionen för Genetik och Patologi (Lena Claesson-Welsh) då kompetens och resurser för vidare analyser av insamlat material finns där. P Åkerud väl förtrogen med tänkta analysmetoder och nu verksam kirurgen, UAS kommar att vara delaktig i analyserna.
Fortsatt samarbete mellan Landstinget i Värmland och Uppsala känns angeläget då de personer som idag är inblandade har en god kontakt. Resurser behövs dock för att kunna underhålla detta och för att se till att resultaten kan skördas. Syftet är också att P Hede ska doktorandregistreras på sikt.

Publicering

Studien som vi nu söker pengar för beräknas ge resultat som kan sammanfattas i några stycken olika publikationer. Möjliga tidskrifter att skicka till är: Cancer Research, Int. J. Cancer, Clin Colorectal Cancer, Ann Surg Oncol.

---