Snabb typning av mikrober som orsakar sepsis ("blodförgiftning") med en ny teknik.
Diarienummer : RFR-31291
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Jonas Blomberg, 2008-09-25
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Professor/Överläkare
Arbetsplats vid ansökningstillfället : Uppsala Universitet, Inst. för medicinska vetenskaper, klinisk virologi
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2010-04-07
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Jonas Blomberg
Läkare, Akademiska Sjukhuset, Uppsala +Uppsala Universitet, Inst. för medicinska vetenskaper, klinisk virolo

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

Sammanfattning

"Blodförgiftning", mer precist: sepsis, är en infektion som obehandlad ofta leder till döden. Sepsis är vanligt förekommande som komplikation till lokala infektioner. Snabb diagnos är viktig. Nuvarande diagnostik är relativt tidskrävande, cirka två dygn behövs ofta för att identifiera vilken bakterie som givit infektionen. Vi utvecklar i ett regionalt samarbete mellan tre mikrobiologiska laboratorier en ny teknik för snabb identifikation av de vanligaste bakterier som ger sepsis. Just nu har vi tekniken fungerande för streptokocker, stafylokocker och enterokocker, men tanken är att täcka 99% av de bakterier som ger sepsis i vår region. Tekniken ger också information om resistensegenskaper, och vi har flera antibiotikaresistensgener med i vår meny. Därigenom kan en ganska detaljerad rapport om vilken bakterie patienten har, och något om dess resistensegenskaper. I första hand avser vi att ge en sådan rapport efter ett dygns blododling. Tekniken tar c:a tre timmar, och innebär alltså en tidsvinst på c:a ett dygn.
I en senare utvecklingsfas hoppas vi kunna göra tekniken så känslig att blododlingen inte behövs. Då kan svaret ges tre timmar efter att provet kom till laboratoriet, vilket är ytterligare en väsentlig förbättring.

---

Medarbetare/Medsökande

Björn Herrmann
Annan tjänstetitel, Akademiska sjukhuset, Klinisk mikrobiologi, Uppsala

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Deltar i

Patientrekrytering:

Ja, fortlöpande från blododlingar från patienter som givit sitt tillstånd

Arbetsenhet:

Akademiska Sjukhuset

Per Olcén
Läkare, Laboratoriemedicinska kliniken/Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

Länstillhörighet:

D

Projektledning:

Deltar i

Patientrekrytering:

Ja, bevakar blododlingar från patienter i Örebro, som givit sitt tillstånd.

Arbetsenhet:

Örebro Universitetssjukhus

Magnus Thore
Läkare, Klinisk Mikrobiologiska Laboratoriet, Västerås

Länstillhörighet:

Västmanland

Projektledning:

Deltar i

Patientrekrytering:

Bevakar positiva blododlingar från patienter som givit tillstånd.

Arbetsenhet:

Västerås centrallasarett

Daniel Heimer
Läkare, Laboratoriemedicin, Unilabs

Länstillhörighet:

Västmanland

Projektledning:

Deltar i

Patientrekrytering:

Bevakar positiva blododlingar från patienter som givit tillstånd.

Arbetsenhet:

Västerås Centrallasarett

Åsa Melhus
Läkare, Dept of Clinical Microbiology

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Deltar i ledningen. Viktig för selektion av rätt målgen och rätt bakterie för vår metod. Är antibiotikaansvarig vid kliniskt mikrobiologiska sektionen av Akademiska Laboratoriet.

Patientrekrytering:

Bevakar positiva blododlingar från patienter som givit tillstånd.

Arbetsenhet:

Akademiska Sjukhuset, Uppsala

Christina Öhrmalm
Annan tjänstetitel, Klinisk Virologi, Institutionen för medicinsk vetenskap, Uppsala Universitet

Länstillhörighet:

C

Projektledning:

Deltar i

Patientrekrytering:

Deltar ej i.

Arbetsenhet:

Klinisk Mikrobiologi, Akademiska Laboratoriet, Akademiska Sjukhuset, Uppsala

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2009-03-01

Beräknat projektslut

2009-12-31

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Bakgrund och behov.
JB har skrivit en artikel som kortfattat belyser bakgrund och behov av multiplex nukleinsyrebaserad diagnostik inom mikrobiologin ( bifogas[1]). Som framgår av artikeln finns ett stort kliniskt behov av att kunna upptäcka många mikrober (bakterier, svampar och virus) samtidigt. Det kommer att ha många positiva effekter, det kommer att effektivisera och förbilliga mikrobiologisk diagnostik. Teknikerna har också potentialen att på sikt bidra till att föra ut mikrobiologisk diagnostik till primärvården.

Diagnostiska frågeställningar:
I dagsläget kan positiva blododlingar, som larmat i BactAlertsystemet, i viss mån snabbt typas med mikroskopi och agglutinationsreaktioner. Många egenskaper kräver dock en odling 1-2 dygn innan de har fastställts. Gängse bakteriediagnostik bygger på fenotypiska artkaraktärer för typning. Till det kommer behovet att fastställa resistens mot flera olika antibiotika, vilket ytterligare komplicerar den konventionella arbetsgången.
Den ofta pressade kliniska situationen kräver ett system som inom 1-2 timmar kan preliminärtypa positiva blododlingar, och ge en indikation på förekomsten av eventuella antibiotikaresistensgener.
Det finns kommersiella genotypningssystem som täcker en del av behovet, men de kan inte modifieras efter det enskilda laboratoriets behov, och har inte fått stor användning i Sverige.
Genotypning kontra fenotypning
Hela mikrobiologin genomgår just nu en revolution, där etablerade, fenotypiskt baserade, metoder kompletteras med genotypiskt baserade. Under lång tid kommer genotypiska metoder inte att kunna ersätta de fenotypiska. En orsak är kunskapsläget. För många bakteriearter har inte lämpliga genotypiska artkaraktärer slutgiltigt fastlagts. En annan orsak är det variabla innehållet av virulensfaktorer (ex.vis plasmider, patogenitetsöar, bakteriofagöverförda gener) hos många bakterier. Kliniskt viktiga egenskaper är alltså inte entydigt sammankopplade med genotypen för en viss bakterieart. Ett genotypiskt system kan alltså dels behöva ha med både artkaraktärer, virulenskaraktärer och antibiotikaresistenskaraktärer. Detta lilla projekt kan inte utreda denna stora fråga. Vi måste utgå från någorlunda etablerad kunskap och literaturstudier.

Tidigare och preliminära resultat.
I JBs grupp har länge pågått utveckling av nukleinsyrebaserade brett riktade och kvantitativa tekniker för påvisning av virus och andra patogener (artikeln i Laboratoriet). SanntidsPCRbaserade metoder för Herpesgruppens virus (HSV, CMV och EBV), Enterovirus, Polyomavirus, Retrovirus, Coronavirus, Orthomyxovirus, Meningitbakterier och Luftvägsbakterier (pneumokocker, hemophilus och mykobakterier) har utvecklats, antingen inom gruppen, eller i samarbete med andra grupper.
Bioinformatiska dataprogram för påvisning och analys av virala sekvenser har också utvecklats (JB). Ett projekt för multiplex påvisning av mänskliga patogener har bedrivits i c:a ett år. Det föreligger redan resultat som visar att
-Hänglåsprober (ad modum Landegren-Nilsson) med hybridisering, ligering och förstärkning med rullande cirkel och vanlig PCR teknik kan användas för påvisning av mikrobiell nukleinsyra med kliniskt användbar känslighet. Tio olika svamppatogener kan påvisas med en reaktion (Ronnie Eriksson, Magnus Jobs et al, manus).
-Virusvariationen (som är ett diagnostiskt problem f.a. vid vinterkräksjuka, influensa, hepatit C och HIV) kan motverkas med 1. en noggrann bioinformatisk analys av lämpliga målsekvenser, 2. användning av långa prober, och 3. användning av generellt basparande nukleotidanaloger (Christina Öhrmalm et al, manus).
- CÖ har redan i samråd med ÅM utformat prober för många av de i blododlingar
vanligast förekommande bakteriearterna. Problemet med de koagulasnegativa
stafylokockerna (KNS), som är mycket lika Staphylococcus aureus, har ägnats
särskild uppmärksamhet.

Syfte/frågeställning/hypotes

Vi vill stärka diagnostiken vid blodfögiftning (sepsis) i regionen, f.a. Västerås, Örebro och Uppsala. På sikt kommer hela regionen att dra nytta av utvecklingen. Ansökan gäller en ny typ av nukleinsyrebaserad mikrob-påvisning, som beräknas kunna komma i bruk på ganska kort sikt. Se stödjebrev från professor Jan Sjölin, infektionskliniken i Uppsala.

Systemet bygger på enkel nukleinsyremärkning, hybridisering med mikrobspecifika prober, och identifiering med färgkodade kulor i en flödescytometer (Luminex). Det har stor kapacitet i antal prover och antal samtidiga analyser per prov, och arbetar snabbt. För att utnyttja instrumentet krävs en påtaglig egen utvecklingsinsats. I Uppsala finns nu 1 1/2 års erfarenhet av det instrumentet. Det föreslagna systemet kan vara inkörsporten till många andra applikationer av nukleinsyrebaserad diagnostik inom mikrobiologin i regionen.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

På de tre deltagande laboratorierna samlas fortlöpande positiva blododlingar, från patienter som givit tillstånd till sparande av prov för metodutveckling i biobank (vilket är de flesta). Den nya tekniken användes på dessa sparade prover för att etablera sensitivitet och specificitet. Därefter arbetas vi prospektivt, som framgår av planen nedan.

Redovisning av interventionen

Resultatet redovisas i en gemensam vetenskaplig artikel.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Detaljerad projektplan

Fas 1. Explorativ fas med undersökning av renstrukna isolat.
Syftet är att etablera en fungerande prob-panel, och detaljer i hybridiserings- och amplifieringsproceduren. Genotypningsmetoden kommer med stor sannolikhet att behöva modifieras under denna första fas, som enbart är på mikrobiell nivå. Tidsåtgång: c:a 3 månader.

Fas 2. Retrospektiv undersökning av positiva blododlingar.
Här studeras hur väl den snabba genotypningen utfaller jämfört med gängse metodik.
Cirka 50 positiva blododlingar från de deltagande laboratorierna. En insamling av positiva blododlingar måste alltså startas relativt snart.
Proverna analyseras anonymt, retrospektivt. Endast prover där patientens medgivande till "Diagnostik och därmed förenlig verksamhet" föreligger användes. Vi räknar inte med
att behöva kontakta behandlande läkare i denna del av studien. Inget behov av etiskt tillstånd föreligger. Tidsåtgång: c:a 3 månader.

Fas 3. Prospektiv studie av positiva blododlingar.
Om tiden medger studeras fortlöpande metodens funktion i en rutinsituation. Sensitivitet och specificitet beräknas. I denna fas kan ev. behandlande läkare behöva kontaktas om kliniskt relevant information framkommer.
Cirka 50 positiva blododlingar bör om möjligt ingå. Tidsåtgång: c:a 3 månader.

Vilken metod användes?
Metodiken kommer att vara ny, men bygga på etablerade grundprinciper: Nukleinsyreextraktion. Hybridisering till färgkodade kulor. Analys i flödespartikelmätare (Luminex). Exakt uppgift om sensitivitet och specificitet kan inte anges nu, men kommer sannolikt att vara tillräcklig för projektet.

Vilka bakterier ingår?
Eftersom metodiken är ny måste intitialt fokus ligga på ett litet antal bakterier och resistensgener. Stafylokocker (aureus och KNS), Enterokocker (fecalis och faecium), VRE, ctxm (ESBL) och MRSA är med då. När tillfredsställande funktion erhållits med dessa mål vidgas fokus till de tolv vanligaste sepsisbakterierna/svamparna: Koagulasnegativa stafylokocker, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococus faecium, Pseudomonas auruginosa, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Grupp A streptokocker, Citrobacter freundii, Alfastreptokocker. Beroende på hur väl detta utfaller kan sedan ytterligare några bakteriearter läggas till. Denna måttligt breda panel användes sedan för Fas 1 och 2 studien. Vi räknar med att det inte skall vara nämnvärda svårigheter att skapa en för rutinen användbar bredare panel inför Fas 3. Tid och pengar avgör hur ambitiös den skall vara.

Studiens genomförande

När resultaten föreligger samlas vi och går igenom dem. De två BMA (som inte kan benämnas på detta stadium) deltar i analysen.

---

Forskningsetiska överväganden

Eftersom endast prover från patienter som enligt biobankslagen givit tillstånd till användning av provet för metodutveckling behövs inget tillstånd. Projektet gäller ju en förbättrad diagnostik vilket patienten rimligen inte kan ha något emot. Dessutom har svar på provet givits via ordinarie blododlingsrutiner, så någon försämring blir det inte för patienten.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

Behövs ej enligt sökanden.

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

1. Blomberg J, Belak S (2007) Brett riktade och multiplexa mikrobdetektionsmetoder. Nutid och Framtid. Laboratoriet 1: 20-24. (I den artikeln finns referenser till övrigt arbete inom gruppen). Artikeln finns tillgänglig i JB:s personkort.

C Bilagor

Eventuella bilagor som skickas in i pappersformat

Se Jonas Blombergs artikel om multiplex mikrobdiagnostik, i personkortet

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

490 600

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

Christina Öhrmalm, mikrobiolog, Klinisk Mikrobiologi, Akademiska Laboratoriet, Akademiska Sjukhuset, Uppsala. Se hennes CV i personkortet.

Utrustning

På JBs lab fnns redan en Luminex multianalysator, medel behöver ej äskas för den.

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Vi analyserar prover från mkt sjuka patienter, det är så patientnära man kan komma inom klinisk mikrobiologi. Prjektet gäller ju en förbättrad diagnostik.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Det kliniska behovet av snabb typning & prel. antibiotikaresistens

Hos pat. m. svår sepsis/septisk chock har flera studier under senare år visat betydelsen av korrekt insatt antibiotikabehandling och tidpunkt för denna. Inadekvat eller sent insatt antibiotikabehandling leder till såväl ökad mortalitet som förlängda vårdtider. Av detta skäl måste man vid svåra infektioner initialt ge mycket bred antibiotikaterapi, som täcker samtliga tänkbara agens och denna behandling måste sedan behållas till dess odlingssvar och resistensbestämning föreligger. En sådan antibiotikabehandling medverkar dock till att driva resistensutveckling och selektion av resistenta stammar, varför det är av yttersta vikt att en sådan behandling blir så kortvarig som möjligt. Mot bakgrund av ovanstående måste ett projekt som syftar till att snabbt typa orsakande agens och ge information om resistensmönster anses ha en mycket hög klinisk relevans.

Uppsala 15 apr 2008

Jan Sjölin Prof. Inf.klin. Akad. sjh. Uppsala

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

För närvarande arbetar de mikrobiologiska laboratorierna relativt självständigt med sina bloddlingar. Blododlingar är en hjärtefråga för mikrobiologiska labratorier. I Örebro finns dessutom ett mångårigt projekt för förbättrad sepsisdiagnostik. I Uppsala har sedan några år en teknik för samtidig påvisning av många olika mikrober drivits av Jonas Blomberg. Projektet låter de tre laboratorierna samverka för att optimera tekniken för blododlingar. Det behvs också tre laboratorier för att få fram tillräckligt många positiva prover för utvecklingsarbetet.

Publicering

En lämplig tidskrift kan vara J Clinical Microbiology.

---