Molekylärbiologiska metoder för identifiering av mikrobiologisk orsak till lunginflammation
Diarienummer : RFR-30421
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Kristoffer Strålin, 2008-09-23
Arbetsplats vid ansökningstillfället : Infektionskliniken USÖ
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2009-10-07
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Kristoffer Strålin
Läkare, Infektionskliniken USÖ

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

För projekt som beviljats medel av RFR

Molekylärbiologiska metoder för identifiering av mikrobiologisk orsak till lunginflammation ÅTERSKAPAD

Diarienummer : RFR-10294
Beviljat belopp: 150 000 kr.
Beslutsdatum: 2007-04-11

Sammanfattning

Sammanfattning av resultat under år 1
Projektets syfte är att utveckla och utvärdera molekylärbiologiska metoder för att påvisa organismer som orsakar lunginflammation. Under 2007/2008 har en realtids-PCR för detektion och kvantifiering av pneumokocker (Spn9802 fragmentet detekteras) utvecklats och utvärderats på luftvägsprover från lunginflammationspatienter och kontrollpatienter (Abdeldaim et al Diagn Microbiol Infect Dis 2008;60:143). Kvantifieringen av DNA har visat sig göra det möjligt att värdera om pneumokockerna utgör orsak till infektionen (hög koncentration av baketerie-DNA) eller utgör bärarskap (låg koncentration). Metodens styrka är att den är känslig och mer specifik än PCR-metoder baserade på ply genen, som används vid många laboratorier. Vi har också tydligt visat att PCR för ply genen är en ospecifik metod även om kvantitativ PCR teknik används (Abdeldaim et al. Clin Microbiol Infect 2008, accepted for publication).
Vi avser att fortsätta utvärdera den nya PCR metoden mot Spn9802 på luftvägssekret och också på blodprover från lunginflammationspatienter. Fynd i blod ger en säkrare diagnos än fynd i luftvägssekret, eftersom man inte kan vara bärare av pneumokocker i blod. Då blododling är en okänslig metod kunde en fungerande PCR metod vara av stort värde.

En realtids PCR har även utvecklats för snabb och kvantitativ detektion av Haemophilus influenzae som kan orsaka både hjärnhinneinflammation och lunginflammation. Då metoden har testad på ett stort antal bakteriestammar och på nasofarynxaspirat från patienter med lunginflammation och kontroller har den visat sig vara både känslig och specifik. Manuskript är under utarbetande.

---

Medarbetare/Medsökande

Guma Abdeldaim
Biomedicinsk analytiker, Klinisk Mikrobiologi, Uppsala akademiska sjukhus

Länstillhörighet:

Uppsala län Uppsala Universitet

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Nej

Arbetsenhet:

Akademiska sjukhuset

Per Olcén
Läkare, Laboratoriemedicinska kliniken/Mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

Länstillhörighet:

Örebro

Projektledning:

Ja

Patientrekrytering:

Ja

Arbetsenhet:

Klinisk mikrobiologi, Universitetssjukhuset, Örebro

Jens Korsgaard
Dept of Chest Disease, Aarhus University Hospital, Aalborg, Danmark

Länstillhörighet:

Danmark

Projektledning:

Ja, isteget med bronkalveloära lavage.

Patientrekrytering:

Ja, isteget med bronkalveloära lavage.

Arbetsenhet:

Dept of Chest Disease, Aarhus University, Aalborg Hospital, Denmark.

Handledare

Jonas Blomberg
Läkare, Akademiska Sjukhuset, Uppsala +Uppsala Universitet, Inst. för medicinska vetenskaper, klinisk virolo

Björn Herrmann
Annan tjänstetitel, Akademiska sjukhuset, Klinisk mikrobiologi, Uppsala

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2006-05-01

Beräknat projektslut

2010-04-30

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Samhällsförvärvad pneumoni är en vanlig sjukdom med en årlig incidens på ca 1% (1) och en mortalitet på 0-30% i olika subpopulationer (2). Antibiotikabehandlingen vid sjukomen bör om möjligt vara avpassad för att bota patienterna och samtidigt inte bidra till resistensutveckling hos bakterierna (3). Vetskap om pneumonietiologin möjliggör en optimal antibiotikabehandling av patienten. Då man ofta inte lyckas påvisa någon etiologi med konventionella metoder, har utveckling av nya diagnostiska metoder uppmuntrats.
I avhandlingsarbete från USÖ och Linköpings Universitet (Kristoffer Strålin, 2005) utvecklades en multiplex PCR för fyra vanliga pneumonibakterier: pneumokocker, H. influenzae, M. pneumoniae och C. pneumoniae (4). Metoden har utvärderats på övre och nedre luftvägssekret (5, 6) och används nu i rutinbruk vid USÖ. Den har visat sig vara särskilt värdefull hos redan antibiotikabehandlade patienter (5, 6). Nackdelen med metoden är att den fordrar en relativt stor manuell arbetsinsats.
Utvecklingen av realtids-PCR har inneburit nya möjligheter. Med denna metodik erhålls ett resultat snabbare än med konventionell PCR, samtidigt som mindre manuell hantering fordras. Man får dessutom en kvantifiering av DNA-innehållet i provet, vilket förbättrar möjligheterna att skilja mellan bakteriemängder som orsakar infektion respektive bärarskap.
Vid Avdelningen för klinisk mikrobiologi, UAS pågår utvecklingsarbete av molekylärbiologisk diagnostik för att kunna påvisa flera patogena organismer samtidigt. Syftet är att skapa metoder som genom en analysomgång kan ge svar på en medicinsk frågeställning, t ex vilken organism som har orsakat pneumoni hos en patient (7).
I aktuellt samarbetsprojekt avser vi att utveckla och utvärdera kvantitativa realtids-PCR metoder för samtidig identifiering av bakteriella luftvägspatogener, främst pneumokocker och H. influenzae.

Syfte/frågeställning/hypotes

Att utveckla multiplexa realtids-PCR metoder som i en analysomgång ger kvantitativa svar på innehållet av olika luftvägspatogener i luftvägssekret.
Att utvärdera dessa metoder på övre och nedre luftvägssekret från patienter med lunginflammation och kontrollpatienter. Dessa utvärderingar kommer att ligga till grund för val av detektionsgränser för olika populationer och provarter.
Att utveckla och utvärdera en känslig metod för detektion av pneumokock-DNA i blod hos patienter med lunginflammation.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

Projektet är ett utvecklingsarbete av molekylärbiologisk diagnostik som syftar till att med hög specificitet och sensitivitet snabbt kunna detektera luftvägsbakterier.

Steg 1. Vi har tagit fram en kvantitativ realtids-PCR för pneumokocker, där vi detekterar Spn9802 fragmentet – den mest specifika DNA sekvensen för pneumokocker som hittills påvisats (9, 10). Utvecklingen av metodenen och utvärdering på nasofarynxaspirat från 166 pneumonipatienter och 84 kontrollpatienter har publicerats i en vetenskaplig artikel (8).

Steg 2. Då specifik metodik är viktig för korrekt diagnostik och vård så har vi gjort en
jämförande studie mellan olika målgener för PCR-metoder. Vi har här visat att PCR mot den ofta använda ply-genen ger falskt positiva resultat, även om kvantitativ PCR teknik används. Dessa fynd har vi sammanställt i en artikel som nyligen accepterats för publikation (11).

Steg 3. Vi har utvecklat en kvantitativ realtids-PCR för H. influenzae. Metoden är utvärderad på samma nasofarynxaspirat som i tidigare studie (5) och ett manuskript ska skickas in under oktober månad.

Steg 4. Vi bedriver nu ett fortsättningsarbete där vi kombinerat de ovan utvecklade metoderna med en metod för detektion av meningokocker och skapat en kvantitativ multiplex realtids-PCR för pneumokocker, H. influenzae och meningokocker. Denna metod kan då användas för både diagnostik av luftvägsinfektioner och bakteriell hjärnhinneinflammation.
Den nya multiplexa PCR-metoden ska nu utvärderas på bronchoalveolärt lavage från patienter med nedre luftvägsinfektion och kontrollpatienter från en tidigare studie (6). Då 2/3 av patienterna behandlades med antibiotika vid tidpunkten för bronkoskopin, möjliggör populationen en utvärdering av betydelsen av antibiotikabehandling för de kvantitativa PCR resultaten.

Steg 5. Vi avser att testa sputumprover från vår tidigare studie (5) med den nya multiplexa PCR-metoden. Kvantitativa resultat av nasofarynxaspirat och sputumprover kommer att jämföras på individbasis och metoden kommer att utvärderas mot gängse referensmetoder som blododling, sputumodling och urinantigentest.

Steg 6. Den publicerade metoden för pneumokockdiagnostik (8) ska nu användas för utvärdering av detektion av pneumokocker i blodprover. Frysta EDTA-blodprover från pneumonipatienterna och kontrollpatienterna i vår prospektiva pneumonistudie (5) kommer att användas i denna utvärdering. Eftersom metoden är snabb och förhållandevis känslig kan den förbättra diagnostiken vid sepsisfrågeställning.

Steg 7. Vi har även påbörjat utveckling av PCR-diagnostik för Mycobakterier. Nukleinsyrabaserad metodik ger betydligt snabbare analys än konventionell odling. Hittills erhållna resultat visar att metoden är känslig och kan påvisa både Mycobacterium tuberculosis och de 8 arter av atypiska mycobakterier som är mest kliniskt signifikanta.

Redovisning av interventionen

Ej applicerbart på projektet.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Patientproverna i studien är redan insamlade och journalgenomgångarna för patienterna är slutförda.

Efter odling har proverna förvarats frysta i -70 grader C. Inför PCR analyserna görs DNA extraktion.

I bearbetningen analyseras sensitivitet, specificitet och prediktiva värden att diskuteras för patienter med pneumoni av olika svårighetsgrad (enligt Pneumonia Severity Index och CURB-65 (3)) och patienter med eller utan pågående antibiotikabehandling vid provtagningen. Kvantifiering av påvisade bakterier är viktig för att höja kvalitén i diagnostiken. Kontrollgrupperna kommer att ha stor betydelse för värderingen av vilket bärarskap som metoderna detekterar.

Studiens genomförande

Patientprover är redan insamlade för tidigare studier (5, 6) och alla ingående patienter gav samtycke till att delta i studierna.
Proverna har redan testats vid Universistetssjukhuset i Örebro och analyseras nu med nya metoder vid Sektionen för klinisk mikrobiologi, Akademiska sjukhuset, Uppsala.

---

Forskningsetiska överväganden

Våra prospektiva studier (3, 4, 5) har tidigare godkänts av etiska kommittéer. Aktuella delstudier innebär ingen ny etisk frågeställning.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

1999-09-20

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

§ 868

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

1. Jokinen C, Heiskanen L, Juvonen H, et al. Incidence of community-acquired pneumonia in the population of four municipalities in eastern Finland. Am J Epidemiol 1993;137:977-88.
2. Fine MJ, Smith MA, Carson CA, et al. Prognosis and outcomes of patients with community-acquired pneumonia. A meta-analysis. JAMA 1996;275:134-41.
3. Hedlund J, Strålin K, Örtqvist Å, Holmberg H. Swedish guidelines for the management of community-acquired pneumonia in immunocompetent adults. Scand J Infect Dis 2005;37:791-805.
4. Strålin K, Bäckman A, Holmberg H, Fredlund H, Olcén P. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used on sputum samples. APMIS 2005;113:99-111.
5. Strålin K, Törnqvist E, Kaltoft MS, Olcén P, Holmberg H. Etiologic diagnosis of adult bacterial pneumonia by culture and PCR applied to respiratory tract samples. J Clin Microbiol 2006;44:643-5.
6. Strålin K, Korsgaard J, Olcén P. Evaluation of a multiplex PCR for bacterial pathogens applied to bronchoalveolar lavage. Eur Respir J 2006;28:568-75.
7. Blomberg J, Belák S. Brett riktade och multiplexa mikrodetektionsmetoder. Nutid och framtid. Laboratoriet 2007;1:20-4.
8. Abdeldaim G, Strålin K, Olcén P, Blomberg J, Herrmann B. Towards a quantitative DNA-based definition of pneumococcal pneumonia: A comparison of Streptococcus pneumoniae target genes, with special reference to the Spn9802 fragment. Diagn Microbiol Inf Dis 2008, 60:143-150.
9. Suzuki N, Seki M, Nakano Y, Kiyoura Y, Maeno M, Yamashita Y. Discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci by genomic subtractive hybridization. J Clin Microbiol 2005;43:4528-34.
10. Suzuki N, Yuyama M, Maeda S, Ogawa H, Mashiko K, Kiyoura Y. Genotypic identification of presumptive Streptococcus pneumoniae by PCR using four genes highly specific for S. pneumoniae. J Med Microbiol 2006;55:709-14.
11. Abdeldaim G, Herrmann B, Korsgaard J, Olcén P, Blomberg J, Strålin K. Is quantitative PCR for the pneumolysin (ply) gene useful for detection of pneumococcal lower respiratory tract infection? Clin Microbiol Infect 2008, accepted for publication.

C Bilagor

Tillstånd från andra myndigheter

Ej aktuellt för projektet.

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

628 000

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

Projektledaren är med i utvecklingen av PCR metoderna och leder bearbetningen av analysresultaten och skrivandet av vetenskapliga artiklar.

Doktorand Guma Abdeldaim utvecklar och optimerar PCR metoderna och analyserar alla prover i studierna. Parallellt med detta deltar han i bearbetningen av resultat och skriver artiklar tillsammans med medarbetarna.

Angivna kostnader inkluderar sociala avgifter.

Medicinsk service

PCR reagenser 35000
Sekvenseringsreagenser 10000
DNA preparering 25000
Odlingar och andra labkostnader 10000

Övrigt

Resor och konferensavgifter 15000

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

Projektet baseras på kliniska patientprover som efter ordinarie rutinanalyser används till utvärdering av nya diagnostiska metoder. Vi har i projektet redan visat att korrekt diagnostik kan göras snabbare och ge en bättre kvalité på analyser jämfört med konventionell odling. Detta leder till mindre användning av bredspektrumantibiotika och kan samtidigt ge diagnos när antibiotika redan är insatt och bakterieodling ej är möjlig.
Projektet är således mycket patientnära.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Projektet har direkt klinisk relevans i flera avseenden:
1. Ökad specificitet. Genom att förbättra specificiteten i de utvecklade metoderna erhålls en kvalitetshöjning av diagnostik av viktiga patogena bakterier. Falskt positiva analyssvar undviks.
2. Ökad snabbhet. Genom att man uppnår snabbare diagnostik på infektioner som kan vara akuta och livshotande förbättras vården av patienter och man kan ge en effektivare antibiotikabehandling.
3. Kvantifiering. Genom att kvantifiera antalet bakterier i dessa nya metoder kan man få en mer precis diagnostik där man bättre kan urskilja sjukdomsorsakande infektion från bärarskap av patogena bakterier.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

Projektet bygger helt på samarbete mellan Akademiska sjukhuset, Uppsala och Universistetssjukhuset Örebro. Detta kommer till uttryck i att den doktorand som arbetar med projektet har handledare både från Uppsala och Örebro. Handledarna kommer både från klinisk verksamhet och laboratorier, dvs projektet är väl förankrat i vårdens verksamhet.

Publicering

Se nedan under Vetenskaplig redovisning.

---

F Vetenskaplig redovisning - gäller endast för fortsättningsansökningar

Rapporteringsläge

Lägesrapport

Rapporteringsdatum

2008-10-01

Publikationer

Publikationer som resultat av projektet
1. Abdeldaim G, Strålin K, Olcén P, Blomberg J, Herrmann B. Towards a quantitative DNA-based definition of pneumococcal pneumonia: A comparison of Streptococcus pneumoniae target genes, with special reference to the Spn9802 fragment. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 2008, 60:143-150.

2. Abdeldaim G, Herrmann B, Korsgaard J, Olcén P, Blomberg J, Strålin K.
Is quantitative PCR for the pneumolysin (ply) gene useful for detection of pneumococcal lower respiratory tract infection? Clinical Microbiology and Infection. Accepted for publication.

Manuskript under utarbetande eller som planeras skrivas under 2009/2010
3. Abdeldaim G, Strålin K, Kirsebom, L, Olcén P, Blomberg J, Herrmann B.
Detection of Haemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patients by quantitative real-time PCR.

4. En artikel om kvantitativ multiplex realtids-PCR för pneumokocker, H. influenzae och meningokocker. Denna metod kan då användas för både diagnostik av luftvägsinfektioner och bakteriell hjärnhinneinflammation.

5. Sputumprover kommer att analyseras med den nya multiplexa PCR-metoden. Kvantitativa resultat kommer att jämföras på individbasis och metoden kommer att utvärderas mot gängse referensmetoder.

6. Den publicerade metoden för pneumokockdiagnostik (ref 1) ska användas för utvärdering av detektion av pneumokocker i blododlingar.

7. En artikel om PCR-diagnostik för Mycobakterier. Nukleinsyrabaserad metodik ger betydligt snabbare analys än konventionell odling. Vår nya metod ska kunna påvisa både Mycobacterium tuberculosis och atypiska mycobakterier.

Deltagande på kongresser där resultat från projektet har presenterats
1. Scandinavian Society for Antimicrobial Chemotherapy, 2006; Uppsala, Sweden 2006.

2. Vårmöte för Föreningen för medicinsk mikrobiologi, Stockholm 2007.

3. Abdeldaim G, Strålin K, Korsgaard J, Olcén P, Blomberg J, Herrmann, B. Detection of bacterial pneumonia by quantitative PCR, with special reference to Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, Spanien, April 19-22, 2008

Vetenskaplig progress och studiens genomförande

Arbetet har framskridit enligt planering. Metoder har utvecklats och genom att vi har tillgång till goda kliniska provmaterial med kontrollgrupper så har utvärderingsfasen varit effektiv och vi har kunnat visa på kvalitetsförbättringar.
Genom att vi har en doktorand som genomför metodutveckling och utvärdering på heltid så har projektet kunnat avancera enligt planen. Denna doktorand har tidigare till stor del kunnat finansieras med andra externa medel från utlandet. Detta upphör 2009 och därför är det av största vikt att medel beviljas för att projektet ska kunna fortgå enligt uppgjord plan.

Resultat

Projektet är ett utvecklingsarbete av molekylärbiologisk diagnostik och resultaten kan sammanfattas enligt vad som är angivet i stycket om Design och urval:

Steg 1. Vi har tagit fram en kvantitativ realtids-PCR för pneumokocker, där vi detekterar Spn9802 fragmentet – den mest specifika DNA sekvensen för pneumokocker som hittills påvisats (9, 10). Metoden har använts på nasofarynxaspirat från 166 pneumonipatienter och 84 kontrollpatienter och nu resulterat i en publicerad metod (8).

Steg 2. Då specifik metodik är viktig för korrekt diagnostik och vård så har vi gjort en jämförande studie mellan olika målgener för PCR-metoder. Utifrån resultaten har vi visat att den vanligen förekommande ply-målgenen ger falskt positiva resultat för diagnos av lunginflammation, vilket kan leda till felaktig behandling. Dessa fynd har vi sammanställt i ett manuskript som nyligen accepterats för publikation.

Steg 3. Vi har utvecklat en kvantitativ realtids-PCR för H. influenzae. Metoden är utvärderad på samma nasofarynxaspirat som i tidigare studie (5) och ett manuskript ska skickas in under oktober månad.

Steg 4 o 5. Vi bedriver nu ett fortsättningsarbete där vi kombinerat de ovan utvecklade metoderna med en metod för detektion av meningokocker och skapat en kvantitativ multiplex realtids-PCR för pneumokocker, H. influenzae och meningokocker. Denna metod kan då användas för både diagnostik av luftvägsinfektioner och bakteriell hjärnhinneinflammation.
Den nya multiplexa PCR-metoden ska nu utvärderas på bronchoalveolärt lavage från patienter med nedre luftvägsinfektion och kontrollpatienter från en tidigare studie (6). På liknande sätt avser vi att testa sputumprover.

Steg 6. Med specifik PCR för pneumokocker har vi börjat analysera EDTA-blodprover från pneumonipatienter och kontrollpatienter. Vi avser också att jämföra denna metod med en bredare PCR metod för bakterie-DNA i blod, vilken för närvarnde utvärderas vid Universitetssjukhuset Örebro, i samarbete med Akademiska Sjukhuset i Uppsala.

Steg 7. Vi har även påbörjat utveckling av PCR-diagnostik för Mycobakterier. Hittills erhållna resultat visar att metoden är känslig och kan påvisa både Mycobacterium tuberculosis och de 8 arter av atypiska mycobakterier som är mest kliniskt signifikanta.

Ekonomisk redovisning

Erhållet anslag 150 000 kr har använts enligt följande:

Kostnad Äskat belopp Använt belopp
Läkare 197 800 0, planerat uttag under hösten 2008, våren 2009
Doktorand 140 000 75 000
Laboratoriereagenser 90 000 30 000

Populärvetenskaplig sammanfattning av resultat

Projektet Molekylärbiologiska metoder för identifiering av mikrobiologisk orsak till lunginflammation (Molecular detection methods for identification of microbiological agents to pneumonia) syftar till att utveckla förbättrade metoder för att påvisa mikroorganismer (främst bakterier) som orsakar lunginflammation. Traditionell diagnostik bygger på odling av bakterier, vilket är en metod som är förhållandevis långsam och för vissa bakterier kan ta flera veckor. Molekylärbiologisk metodik som polymeraskedjeamplifiering (PCR) kan erbjuda en snabbare diagnostik som dessutom är känsligare, dvs den kan påvisa några få bakterier i ett patientprov. Dessutom kan PCR-metodik bestämma antalet bakterier i ett prov. Detta innebär att man bättre kan avgöra om en patient som är infekterad med sjukdomsorsakande bakterier verkligen blivit sjuk av dessa bakterier eller om man bara är bärare av dem. Genom att PCR-metodik kan påvisa döda bakterier så kan man även detektera bakterier som utsatts för antibiotika och inte kan odlas.
Vi har nu utvecklat specifik PCR-metodik för påvisande av pneumokocker och Haemophilus influenzae, två bakteriearter som orsakar lunginflammation och hjärnhinneinflammation. Utvärdering av metoderna visar att de höjer kvalitén i diagnostiken av patientprover.

Planerad spridning och implementering

Förutom vetenskapliga publikationer har föredrag hållits på lokala, nationella och internationella sammankomster för professionen. Resultaten ligger också till grund vid utarbetande av nya vårdprogram för patienter.