Trumhinnans morfologi och biokemi i relation till retraktionssjukdom
Diarienummer : RFR-29091
Ny ansökan RFR oktober 2008
Ansökan påbörjad av : Johan Knutsson, 2008-09-20
Yrkestitel vid ansökningstillfället : Specialistläkare
Arbetsplats vid ansökningstillfället : ÖNH-kliniken Västmanland
Senast ändrad/åtgärdad av : Marianne Omne-Pontén, 2009-08-20
Ansökan inkommen till : Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen
Beslutad - beviljad, kostnadsställe redovisat

Sökanden: Johan Knutsson
Läkare, ÖNH-kliniken Västmanland samt Centrum för Klinisk Forskning Västmanland

A Övergripande projektinformation

Kön på huvudsökanden

man

Sammanfattning

Bakgrund
Akut öroninflammation hör till de vanligaste sjukdomar som drabbar barn. Vissa av dessa barn utvecklar senare under livet en kronisk form av öroninflammation, s.k. retraktionssjukdom. Denna kan medföra hörselnedsättning, öronflytning och yrsel, och kan vid pärlcystebildning vara potentiellt livshotande. Pärlcysta är en djup trumhinneficka som expanderar på ett tumörliknande, bendestruktivt sätt men är inte en cancer. Sjukdomen kräver ofta avancerad kirurgisk behandling. I centrum för sjukdomsprocesserna står retraktionsfickor i trumhinnan. I våra tidigare studier har vi visat att akut, experimentell öroninflammation och öronkatarr kan ge styvhetsförsvagning av trumhinnan, redan efter kort tid (dagar - veckor). Undersökningarna var utförda med en av oss särskilt utvecklad mätmetod, moaré interferometri, där trumhinnans förskjutning vid tryckbelastning kunde fastställas, utgörande ett mått på trumhinnans styvhetsegenskaper. Kombinationen av trumhinneförsvagning och undertryck i mellanörat misstänks förorsaka retraktionen. Vi har studerat trumhinnans styvhetsuppehållande fibrer med morfologiska undersökningar vid öroninflammation, och där påvisat svullnad. Denna svullnad kan dock inte tillräckligt förklara de ofta kraftiga försvagningar som uppmätts. Hos människa har man kunnat påvisa upplösning av trumhinnans fiberskikt efter lång tids kronisk öronkatarr, men strukturella förändringar har inte påvisats i tidigt skede (dagar – veckor) av öroninflammation.

Syfte
Studien avser att klarlägga de destruktiva inflammatoriska mekanismerna som drabbar trumhinnan, samt de efterföljande läkningsprocesserna. I den första delstudien har studier på råtta gjorts, medan humant material analyseras i fortsatta delstudier.

Metod
Immunohistokemiska undersökningar av normal trumhinnor från råtta och människa samt humana trumhinnor som utvecklat sjukdom, exempelvis retraktion eller kolestatom.

Hypotes
Vid akut inflammation förändras trumhinnans fiberskikt med nedbrytning av kollagenfibrerna. Vid läkningsfasen produceras andra kollagentyper än de normalt förkommande och dessa lagras på ett onormalt sätt, varigenom trumhinnan permanent försvagas.

Klinisk relevans
Ökad kunskap om hur trumhinnans bindvävselement skadas vid öroninflammation ger förutsättningar att finna nya och effektiva behandlingsmetoder för att motverka skador som följd av kronisk öroninflammation.

---

Handledare

Magnus von Unge
Läkare, ÖNH-klin och CKF, Landstinget Västmanland

Utbildning

doktorandutbildning

Översikt av projektorganisation

---

Projektstart

2005-05-12

Beräknat projektslut

2010-12-31

---

B Projektbeskrivning

Bakgrund

Bakgrund
Akut öroninflammation hör till de vanligaste sjukdomar som drabbar barn. Vissa av dessa barn utvecklar senare under livet en kronisk form av öroninflammation, s.k. retraktionssjukdom. Denna kan medföra hörselnedsättning, öronflytning och yrsel, och kan vid pärlcystebildning vara potentiellt livshotande. Pärlcysta är en djup trumhinneficka som expanderar på ett tumörliknande, bendestruktivt sätt men är inte en cancer. Sjukdomen kräver ofta avancerad kirurgisk behandling. I centrum för sjukdomsprocesserna står retraktionsfickor i trumhinnan. I våra tidigare studier har vi visat att akut, experimentell öroninflammation och öronkatarr kan ge styvhetsförsvagning av trumhinnan, redan efter kort tid (dagar - veckor). Undersökningarna var utförda med en av oss särskilt utvecklad mätmetod, moiré interferometri, där trumhinnans förskjutning vid tryckbelastning kunde fastställas, utgörande ett mått på trumhinnans styvhetsegenskaper. Kombinationen av trumhinneförsvagning och undertryck i mellanörat misstänks förorsaka retraktionen. Vi har studerat trumhinnans styvhetsuppehållande fibrer med morfologiska undersökningar vid öroninflammation, och där påvisat svullnad. Denna svullnad kan dock inte tillräckligt förklara de ofta kraftiga försvagningar som uppmätts. Hos människa har man kunnat påvisa upplösning av trumhinnans fiberskikt efter lång tids kronisk öronkatarr, men strukturella förändringar har inte påvisats i tidigt skede (dagar – veckor) av öroninflammation.

Syfte/frågeställning/hypotes

Syfte
Studien avser att klarlägga de destruktiva inflammatoriska mekanismerna som drabbar trumhinnan, samt de efterföljande läkningsprocesserna. I den första delstudien planeras studier på råtta, medan humant material ska analyseras i senare delstudier.

Hypotes
Vid akut inflammation förändras trumhinnans fiberskikt med nedbrytning av kollagenfibrerna. Vid läkningsfasen produceras andra kollagentyper än de normalt förkommande och dessa lagras på ett onormalt sätt, varigenom trumhinnan permanent försvagas.

Design och urval (ex. urval, gruppindelning)

Delstudie I
Mål: Att identifiera kollagenfibertyperna i den friska trumhinnans pars tensa hos råtta.

Material: Trumhinnor från 10 friska Sprague-Dawleyråttor.

Resultaten är publicerade: Knutsson J, Bagger-Sjoback D, von Unge M. Distribution of different collagen types in the rat's tympanic membrane and its suspending structures. Otology & Neurotology. 2007 Jun;28(4):486-91.

Delstudie II
Mål: Att identifiera kollagenfibertyperna i friska humantrumhinnor samt karaktärisering av den humana trumhinnan med särskild inriktning på lamina propria, dvs det styvhetsbärande skiktet i trumhinnan.

Material: Trumhinnepreparat från människa bestående av normala trumhinnor erhållna från operation av tumörer på hörselnerven som vi tillhandhålls genom ett samarbete med professor Rask-Andersen vid Akademiska sjukhuset. Trumhinnan tas rutinmässigt bort som en del av en operation av en tumör på hörselnerven varför trumhinnan i sig inte är påverkad av sjukdom.

Delstudie III
Mål: Att om möjligt identifiera progenitorceller i friska humantrumhinnor med huvudinriktning på yttre epiteliala skiktet av trumhinnan

Material: Trumhinnepreparat från människa bestående av normala trumhinnor erhållna från operation av tumörer på hörselnerven som vi tillhandhålls genom ett samarbete med professor Helge Rask-Andersen vid Akademiska sjukhuset. Trumhinnan tas rutinmässigt bort som en del av en operation av en tumör på hörselnerven varför trumhinnan i sig inte är påverkad av sjukdomen.

Delstudie IV
Mål: Att identifiera kollagenfibertyperna i humantrumhinnor som utsatts för långvarig mellanörekatarr eller utvecklat retraktionssjukdom/kolesteatom.

Material: Trumhinnepreparat från människa som har haft långvarig mellanörekatarr eller utvecklat retraktionssjukdom/kolesteatom. Materialet erhålls i samband med trumhinnebiopsi när opereras in pga mellanörekatarr. Material erhålls också då patienter opereras för sin retraktionssjukdom/kolesteatom varvid den sjuka trumhinnan tas bort. Materialinsamling pågår.

Redovisning av interventionen

Ingen regelrätt intervention sker då forskningen görs på biopsier och operationspreparat. Den behandling patienter får är inte avhängig forskningen utan endast styrd av patientens sjukdom.

Metod och datainsamling/ -bearbetning

Delstudie I
Metoder: Ljusmikroskopi. Immunohistokemi för identifiering av de vanligast förekommande kollagentyperna (I, II, III och IV).

Delstudie II
Metoder: Ljusmikroskopi. Immunohistokemi för identifiering av de vanligast förekommande kollagentyperna (I, II, III och IV). Jämförelse kommer att ske med identifierade kollagenfibertyper i rått-trumhinnor.

Delstudie III
Metoder: Ljusmikroskopi. Immunohistokemi med immunofluorescens för identifiering av olika markörer för progenitorceller/stamceller.

Delstudie IV
Metoder: Ljusmikroskopi och elektronmikroskopi. Immunohistokemi för identifiering av de vanligast förekommande kollagentyperna (I, II, III och IV). Jämförelse kommer att ske med tidigare studerade friska trumhinnor.

Studiens genomförande

Delstudie 1 är genomförd och resultaten är publicerade
Knutsson J, Bagger-Sjoback D, von Unge M. Distribution of different collagen types in the rat's tympanic membrane and its suspending structures. Otology & Neurotology. 2007
Jun;28(4):486-91.
Delstudie 2 är genomförd, artikel håller på att skrivas.
Delstudie 3 har initierats, material finns insamlat.
Delstudie 4: Materialinsamling pågår

---

Forskningsetiska överväganden

I delstudie 1 har trumhinnor från råttor använts, djuretiskt tillstånd finns (N344/02 Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd, Stockholms Tingsrätt.) Studien genomfördes på Karolinska.

I delstudie 2, 3 och 4 används humanmaterial som tas i samband med att del av eller hela trumhinnan avlägsnas pga sjukdom. Detta är rutinförfarande vid operationen varför detta inte påverkar patienten.
Tillstånd enl nedan beroende på vilken typ av operation som görs.

Etisk prövning

Ansökan till etikprövningsnämnden är gjord eller planeras

Datum för beslut från etikprövningsnämnden

2003-11-03

Diarienummer på beslut från etikprövningsnämnden

344-02 (djur); samt 03-523 (Karolinska)

Etisk prövning behövs ej

Ansvarig forskningsledare bedömer att etisk prövning ej behövs.

---

Referenser

Wells MD, Michaels L. Role of retraction pockets in cholesteatoma formation. Clin Otolaryngol Allied Sci. 1983 Feb;8(1):39-45

Ars BM. Tympanic membrane retraction pockets. Etiology, pathogeny, treatment. Acta otorhinolaryngol Belg. 1991;45(3):265-77. Review.

Ars B, De Craemer W, Ars-Piret N. The lamina propria and cholesteatoma. Clin Otolaryngol 1989 Oct;14(5):471-5

von Unge M, Bagger-Sjoback D. Tympanic membrane changes in experimental otitis media with effusion. Am J Otol. 1994 Sep;15(5):663-9.

von Unge M, Decraemer WF, Dirckx JJ, Bagger-Sjoback D. Shape and displacement patterns of the gerbil tympanic membrane in experimental otitis media with effusion. Hear Res. 1995 Feb;82(2):184-96

Lim DJ. Human tympanic membrane. An ultrastructural observation. Acta Otolaryngol. 1970 Sep;70(3):176-86.

Lim DJ. Structure and function of the tympanic membrane: a review. Acta Otorhinolaryngol Belg. 1995;49(2):101-15. Review.

von Unge M, Decraemer WF, Bagger-Sjoback D, Van den Berghe D. Tympanic membrane changes in experimental purulent otitis media. Hear Res. 1997 Apr;106(1-2):123-36.

Miller EJ. The structure of fibril-forming collagens. Ann N Y Acad Sci. 1985;460:1-13.
Kuhn K, Glanville RW. Molecular structure and higher organization of different collagen types. Biology of Collagen 1980;1-14

Wick G, Nowack H, Hahn E, Timpl R, Miller EJ. Visualization of type I and II collagens in tissue sections by immunohistologic techniques. J Immunol. 1976 Jul;117(1):298-303.

Yoo TJ, Tomoda K. Type II collagen distribution in rodents. Laryngoscope. 1988 Nov;98(11):1255-60.

Adamson ED, Ayers SE. The localization and synthesis of some collagen types in developing mouse embryos. Cell. 1979 Apr;16(4):953-65.

Uno Y. The attachment structure of the guinea pig tympanic membrane. Auris Nasus Larynx. 2000 Jan;27(1):45-50.

Commo S, Gaillard O, Bernard BA. The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath: a unifying hypothesis for stem cell reservoir? Differentiation 2000; 66(4-5):157-64.

Kaur P. Interfollicular epidermal stem cells: identification, challenges, potential. J Invest Dermatol 2006; 126(7):1450-8.

Kaur P, Li A, Redvers R, Bertoncello I. Keratinocyte stem cell assays: an evolving science. J Investig Dermatol Symp Proc 2004; 9(3):238-47.

Larouche D, Hayward C, Cuffley K, Germain L. Keratin 19 as a stem cell marker in vivo and in vitro. Methods Mol Biol 2005; 289:103-10.

Li A, Kaur P. FACS enrichment of human keratinocyte stem cells. Methods Mol Biol 2005; 289:87-96.

Tanaka Y, Shiwa M, Kojima H, et al. A study on epidermal proliferation ability in cholesteatoma. Laryngoscope 1998; 108(4 Pt 1):537-42.

Terunuma A, Kapoor V, Yee C, et al. Stem cell activity of human side population and alpha6 integrin-bright keratinocytes defined by a quantitative in vivo assay. Stem Cells 2007; 25(3):664-9.

van Rossum MM, Schalkwijk J, van de Kerkhof PC, van Erp PE. Immunofluorescent surface labelling, flow sorting and culturing of putative epidermal stem cells derived from small skin punch biopsies. J Immunol Methods 2002; 267(2):109-17.

Watt FM, Lo Celso C, Silva-Vargas V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev 2006; 16(5):518-24.

Webb A, Li A, Kaur P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation 2004; 72(8):387-95.

C Bilagor

Eventuella bilagor som skickas in i pappersformat

Humanetiska tillstånd:
No.99398, 22/9 1999, (Uppsala)
No. C254/4,(Uppsala)
No. C45/7 2007 (Uppsala)
03-523 (Karolinska)

Djuretiskt tillstånd:
N344/02 (Karolinska)

Samtliga skickas som kopior i pappersformat

---

D Sammanfattande kostnadsbeskrivning / budget för projektet

Total budget

Total summa

403 200

Andra bidragsgivare

Andra bidragsgivare

---

Äskade medel från Regionala forskningsrådet i Uppsala- och Örebroregionen

Personal

Biomedicinsk analytiker 80 timmar à 190 kr inkl soc avgifter = 15200 kr

Medicinsk service

Elektronmikroskopi 10 timmar à 500 kr = 5000 kr

Övrigt

Antikroppar till fortsatta immunohistokemiska analyser 15 000 kr
Laboratorievätskor och förbrukningvaror 5000 kr

E Projektledarens egen bedömning

Bedömning i vad mån projektet är patientnära

I våra initiala studier studerade vi råttrumhinnor för att lära oss metoder.
Nu studerar vi trumhinnor från patienter som utvecklat trumhinnesjukdomar och därför opereras. Således är projektet patientnära.

Bedömning av projektets kliniska betydelse

Retraktionssjukdomar i trumhinnor är mycket socialt handikappande då de nedsätter hörseln. Därtill är de resurskrävande då de kräver noggranna frekventa kliniska kontroller hos specialistläkare för att snabbt fånga upp de trumhinneretraktioner som omvandlas till pärlcystebildningar. Detta är en lokalt destruktiv process som kan förstöra hörselbenen, ge kroniskt rinnande öra och kan orsaka svår yrsel. I mer uttalade fall kan benröta (mastoidit) uppkomma eller hjärnhinneinflammation (meningit).
I utvecklade länder klarar man ofta att i viss mån återställa hörseln med mycket resurskrävande avancerad kirurgi. Även efter operation krävs frekventa undersökningar för att snabbt påvisa eventuell återkomst av retraktionsjukdomen, vilket tyvärr inte är ovanligt.

Bedömning av det regionala samarbetet och dess betydelse

ÖNH-kliniken i Västerås har sedan tidigare ett intensivt forskningssamarbete med Karolinska Institutet. Sen två år tillbaka har ett mycket givande samarbete med professor Helge Rask-Andersen i Uppsala inletts. Nu har forskningen fokuserats till Uppsala genom det morfologikunnande som professor Rask-Andersen besitter i kombination med den stamcellsforskning som bedrivs vid institutionen för plastikkirurgi som vi tidigare inte haft tillgång till via våra kontakter på Karolinska.

Publicering

Delstudie 1: är publicerad i Otology & Neurotology. 2007 Jun;28(4):486-91.
Delstudie 2: Planeras att inom kort skickas in till Journal of the Association for Research in Otolaryngology
Delstudie 3: Planeras att skickas till Hearing Research.
Delstudie 4: Planeras att skickas till Hearing Research.

---