1. Översiktlig projektbeskrivning

Engelsk titel

Genetic strategy for a study of Nf1-induced leukemia, induction and treatment by inhibition of RAS-activating enzymes.

Sammanfattning av projektet

Många cancerformer, t.ex. leukemier m.fl. kan uppkomma av mutationer i gener som kodar för RAS-proteiner eller i gener som kodar för proteiner som interagerar med RAS. RAS-proteinerna sitter på insidan av cellmembranet och skickar signaler in till cellkärnan, vilket reglerar ett flertal normala cellfunktioner. Mutationer i generna kan leda till hyperaktiva tillväxtsignaler och därmed till okontrollerad celltillväxt och celldelning. Därför är RAS-proteinerna extremt attraktiva måltavlor för cancerterapi. Vi har två specifika mål: Först skall vi jämföra effekten av att hämma två olika enzymer ( Rce-1 eller Icmt) som normalt sett är nödvändiga för att RAS-proteinerna ska fungera. Vi studerar enzymernas effekter vid utvecklingen av en RAS-inducerad leukemi i möss. Vi ska använda oss av en ny genetisk strategi där vi i vuxna möss kan knocka ut tumörsuppressor - genen Nf1 i benmärgsceller – vilket leder till hyperaktiv RAS-signalering och leukemiutveckling – och samtidigt knocka ut genen som kodar för något av enzymerna Rce-1 eller Icmt. Med denna strategi kan vi avgöra om hämning av något av dessa enzymer kan vara en effektiv strategi för att blockera RAS-inducerad cancer. I den andra delen av vårt projekt kommer vi att utnyttja det faktum att leukemin är inducerbar i vuxna möss utan benmärgstransplantationer. Vi kan då att ta reda på precis vad som händer i benmärgsceller de första timmarna – dagarna efter Nf1-RAS-leukemin har startats igång. Vi kan därigenom få information om vilka gener och signaleringsvägar som styr leukemiutvecklingen. Denna information kommer att vara värdefull för att kunna identifiera nya måltavlor för läkemedel. Vårt projekt kan bidra till att förbättra existerande behandlingar och identifiera nya strategier för att behandla cancersjukdomar som involverar hyperaktiv signalering av RAS-proteiner. Vi är tacksamma för tidigare anslag (2006) som har möjliggjort att vi kunnat avla möss och påbörja de första försöken, vi söker nu en fortsättning.

Typ av projekt

Forskningsprojekt

MeSH-termer för att beskriva ämnesområdet

Inlagda MeSH-termer

Animal Experimentation

The use of animals as investigational subjects.

Biomedical Research

Research that involves the application of the natural sciences, especially biology and physiology, to medicine. (from American Heritage Dictionary, 4th ed)

Investigative Techniques

Investigative techniques used in pre-clinical and clinical research, epidemiology, chemistry, immunology, genetics, etc. They do not include techniques specifically applied to DIAGNOSIS; THERAPEUTICS; anesthesia and analgesia; SURGICAL PROCEDURES, OPERATIVE; and DENTISTRY.

Mice

The common name for the genus Mus.

Genetic Research

Research into the cause, transmission, amelioration, elimination, or enhancement of inherited disorders and traits.

Genetics

The branch of science concerned with the means and consequences of transmission and generation of the components of biological inheritance. (Stedman, 26th ed)

Leukemia

A progressive, malignant disease of the blood-forming organs, characterized by distorted proliferation and development of leukocytes and their precursors in the blood and bone marrow. Leukemias were originally termed acute or chronic based on life expectancy but now are classified according to cellular maturity. Acute leukemias consist of predominately immature cells; chronic leukemias are composed of more mature cells. (From The Merck Manual, 2006)

Projektets delaktighet i utbildning

Avhandling
D-uppsats / Magisterexamen
C-uppsats / Kandidatexamen
ST-läkarutbildning
Annan utbildning
Ej del i utbildning

3. Processen och projektets redovisning

Pågående aktiviteter

Planering och förberedelse före datainsamling
Datainsamling pågår
Analys av insamlade data pågår
Författande av skriftlig redovisning / publikation pågår
En eller flera publikationer från projektet är publicerade
Slutfört och inget mer görs inom ramen för detta projekt

Projektstart (när planeringen påbörjas och börjar dokumenteras skriftligt)

2006-01-01

Datum för påbörjande av datainsamling

2006-01-01

Datum då projektet är slutrapporterat

2014-12-31

Tillämpning av resultat - tidsaspekt (projektledarens bedömning)

Resultaten kommer sannolikt att tillämpas inom 5 år från projektslut.

Tillämpning av resultat - genomslag (projektledarens bedömning)

Internationellt (i flera länder)

4. Detaljerad projektbeskrivning

Bakgrundsbeskrivning

Hyperaktiv signalering hos RAS-proteinerna är en mycket vanlig orsak till uppkomsten av cancersjukdomar som ex. leukemier, tjocktarmscancer m.fl. Hyperaktiv RAS-signalering kan uppkomma genom mutationer i RAS-gener eller i gener som kodar för proteiner som interagerar med RAS, t.ex. NF1, BCR-ABL, FLT3, flera RTK gener, och av hyperaktiv IGF-stimulering. Detta gör att RAS-proteinerna är väldigt attraktiva måltavlor som anticancerterapi. RAS-proteinerna genomgår tre enzymatiska modifikationer i cytoplasman – isoprenyleringlering, endoproteolys och metylering – som leder till att RAS-proteinet kan förankras i cellmembranet. En strategi att hämma RAS-signalering är att hämma de enzymer som är ansvariga för de enzymatiska modifikationerna. Vi ska använda oss av en ny genetisk strategi i möss för att avgöra huruvida hämning av dessa enzymer kan blockera utvecklingen av NF1-RAS-inducerad leukemi och identifiera mekanismer för leukemiutvecklingen för att hitta nya måltavlor för behandling.

Syfte

Vi har två huvudsyften: 1. att avgöra om hämning av enzymer som modifierar RAS-proteiner kan vara en effektiv strategi för att behandla RAS-inducerade cancerformer; och 2. att använda oss av en kraftfull genetisk metod in vivo för att definiera mekanismer för de tidigaste skeendena i cancerutveckling, för att därigenom hitta nya behandlingsstrategier.

Frågeställning / Hypoteser

En typ av läkemedel, som hämmar det RAS-modifierande enzymet FTase har nått kliniska prövningar. Men obesvarade frågor om mekanism och resistensutveckling med detta läkemedel har gjort att vi nu fokuserar på de två andra RAS-modifierande enzymerna, Rce-1 eller Icmt. Vi har visat att hämning av Rce-1 eller Icmt, både med genetiska och farmakologiska metoder, kan reducera tillväxt av cancerceller med hyperaktivt RAS in vitro. Vi har nu utvecklat en genetisk strategi för att studera detta in vivo.

Metod: Gruppindelning

Vi har kontrolldjur och experimentella djur. Kontrolldjurens genotyp är tex. för Icmt Nf1flx/flx Mx1-Cre Icmt flx/+. Injektion av pI-pC i dessa möss leder till att Nf1 knockas ut och att endast en Icmt-allel knockas ut – så att de har kvar Icmt aktivitet. De experimentella djurens genotyp är Nf1flx/flx Mx1-Cre
Icmt flx/flx där injektioner av pI-pC kommer att knocka ut Nf1 och samtidigt knocka ut båda Icmt-allelerna – så att ingen Icmt aktivitet finns kvar. Dessa möss paras nu för försök.
För den statistiska bearbetningen av data, kommer kontrolldjuren och de experimentella djuren med sin ”drug-target” gen, att grupperas i lämpliga grupper (n = 6). Grupper av möss kommer att avlivas vid 1, 2, 4, 6 och 8 månader efter induktion av leukemin för analys av vävnader, blod och benmärg.

Metod: Databearbetning

Vid den statistiska bearbetningen kommer data presenteras som medelvärde + SEM. Skillnader i ex. organvikter, koncentrationer och procent av vita blodkroppar, FACS-analyser, förmågan hos hematopoetiska celler att bilda kolonier, densitometri av proteinband på Western blots m.m., kommer att bestämmas med Student’s t test eller one-way ANOVA med Tukey’s post-hoc test; överlevnadskurvor utvärderas med log-rank test. Även icke-parametriska statistiska test, som Mann-Whitney U-test kommer att användas för den statistiska analysen av skillnader mellan oberoende grupper, samt Wilcoxons teckenrang test kommer att användas vid analysen av beroende grupper.
Publikationer m.m. för redovisning av anslaget för år 2006 kommer att ske senast september-2007.

Resultat

Förväntat resultat: Vi samlar in mätdata just nu och det är en pågående studie.Behandlingen av cancerpatienter har de senaste 25 åren förbättrats avsevärt. Genom en intensiv kemoterapibehandling, möjlighet till benmärgs-transplantation och ett bra omvårdnadsprogram kan patienter med leukemier och tumörer få en bättre prognos, men mortaliteten är fortfarande oacceptabelt hög. Okontrollerad signalering av RAS-proteiner är en vanlig bidragande orsak till de allvarligaste cancerformerna och en orsak till uppkomst samt relaps av cancersjukdomar. Vi har tagit fram en ny strategi för att definiera nya måltavlor för läkemedel och vi kommer att börja med två av de RAS-modifierande enzymerna. Att definiera och jämföra effekten av att hämma dessa enzymers potential som ”drug-targets” för RAS-inducerad cancer, kan bäst besvaras med en genetisk strategi dels in vivo i möss och dels in vitro. Vårt projekt kan bidra till att förbättra existerande behandlingar och identifiera nya strategier för att behandla cancersjukdomar som involverar hyperaktiv RAS-signalering.

Diskussion

Forskningsprojektet fokuserar på ett protein – neurofibromin – som negativt reglerar RAS-proteiner. Neurofibromin-proteinet Nf1 stimulerar till hyperaktivering av RAS-proteiner. Nf1 är en tumörsuppressor-gen och mutationer i denna gen är vanlig hos människor med NF1 syndrom. Hos patienter med Nf1 mutationer ökar därför RAS-signaleringen, det blir en s.k. hyperaktiv RAS-signalering, och detta resulterar i en ökad frekvens av cancer. Med hjälp av våra genetiskt modifierade möss kan man studera en leukemi som sätts igång genom att inaktivera Nf1-genen i benmärgen. Alla möss får en leukemi av myeloproliferativ karaktär (100% penetrans), som har stora likheter med blodsjukdomen JMML hos barn och ungdomar. I denna djurmodell, och med omfattande cellodlingstekniker kan vi testa hypotesen att man kan blockera RAS-signaleringen i celler som saknar Nf1 genom att samtidigt knocka ut genen för ett av de enzym som aktiverar RAS-proteinet direkt efter att det syntetiserats. Detta arbete har krävt omfattande korsningar av musmodeller och isolering och etablering av primära cell-linjer. Vi har nu kommit en bra bit på väg, cell-linjer och möss med rätt genuppsättning har tagits fram och nu testar vi denna strategi. Med hjälp av resultaten från detta projekt börjar vi nu att kunna få fram viktig information om huruvida inaktivering av CAAX-modifierande enzymer, såsom Rce1 och Icmt, kommer att vara en effektiv strategi för att behandla blodcancer hos barn och ungdomar.
Vi har även studerat kombinationen av mutationer i två gener Nf1 och RAS i ett nytt forskningsprojekt, dessa är var för sig kända för sina cancerframkallande egenskaper. Dessa finns ofta i muterad form i akuta leukemier, men mutationerna förekommer mycket sällan tillsammans. Man har hittills antagit att de muterade generna har exakt samma funktion: att de båda två var för sig leder till en ökad aktivitet av det cancerframkallande protein RAS. Den ena genen kodar för proteinet RAS, som är en känd inducerare av celldelningen i flera cancersjukdomar. Den andra genen kodar för proteinet Nf1, som är känd för att minska aktiviteten hos RAS-proteinet, dvs fungerar som tumor suppressor.
Vi har därvid använt oss av två olika typer av möss, där den ena sorten har RAS-mutationen och den andra har Nf1-mutationen. Båda mutationerna var för sig leder till att mössen får en långsamt fortskridande blodcancer. Genom att kombinera de två djurmodellerna ville vi påvisa att möss som har mutationer i båda generna utvecklar en mycket aggressiv akut leukemi.

Slutsats

I mitt projekt har jag gått vidare med våra intressanta resultat och för att se om vi kan bredda betydelsen av att hämma Rce1 och Icmt vid leukemibehandling. Jag kan avgöra om hämning av enzymerna Rce1 och Icmt kan blockera utvecklingen av en letal leukemi som orsakas av inaktivering av tumörsuppressor-genen Nf1.

Jag har avlat Icmt flox/flox Nf1flox/flox möss som också har den interferonkänsliga Cre-transgenen Mx1-Cre. Här är Icmt och Nf1 generna ”floxade” dvs de har loxP-sekvenser på var sida om genen. En i.p.-injektion av interferon i Icmt flox/flox Nf1flox/flox Mx1-Cre möss leder till expression av enzymet Cre i benmärgsceller: Cre knockar ut de ”floxade” Icmt- och Nf1-generna. Kontrollmöss är heterozygota för Icmt allelen (i.e. Icmt flox/+). Cre kommer i kontrollmössen bara att knocka ut en allel av Icmt; dessa möss kommer då att ha kvar tillräckligt med Icmt-aktivitet.

Min hypotes var att kontrolldjuren, där båda Nf1-allelerna men bara en Icmt-allel knockas ut, kommer snabbt att utveckla leukemi. Vi har nu i pilotförsök visat att detta fungerar. Vidare är hypotesen att i de experimentella mössen, där vi knockar ut all Icmt expression, kommer leukemin att ha ett betydligt långsammare förlopp; alternativt kommer mössen att förbli friska. Jag kan härigenom dra slutsatsen att hämning av Icmt kan vara en effektiv strategi att behandla hematologiska maligniteter som orsakas av hyperaktiv RAS-signalering. Vi har nyligen visat att inaktivering av Icmt, kan blockera progressionen av en K-Ras inducerad leukemi hos möss. I det projektet inducerade vi leukemi genom att uttrycka den onkogena formen av K-Ras och den studien har publicerats i Blood (2008) 112(4) 1357-1365.

Jag kommer även att utföra identiska Nf1-studier med Rce1flox/flox möss som nu har avlats upp för försök och vars resultat nu håller på att utvärderas. En tidigare in vivo studie av huruvida knockout av Rce1 kunnat hämma utvecklingen av en K-RAS-inducerad leukemi har genomförts och publicerats i Blood (2007)109:763-768), varvid vi nu går vidare och testar hypotesen rörande hur knockout av Rce1 påverkar utvecklingen av Nf1-inducerad leukemi.

Vi har tagit fram genetiska strategier för att definiera effekten av att hämma dessa två nya intressanta ”drug-targets”, Icmt och Rce1. För att få ”proof-of-principle”-data angående effektiviteten av att hämma ett visst enzym vid behandling av cancer är genetiska strategier i möss väldigt effektiva. I en tidigare publikation har vi även visat att inaktivering av ett annat Ras-modifierande enzym vid namn GGT, kan reducera tumörbildning och förbättra överlevnaden hos möss med en dödlig K-Ras inducerad lungcancer, och resultaten publicerades i J.Clin.Invest. (2007) 117(5): 1294-1304. Våra publikationer i Blood och J. Clin. Invest visar att dessa strategier är effektiva och kan ge definitiva svar.

Vi har även nyligen visat att genom att kombinera två djurmodellerna med två olika typer av möss, där den ena sorten har RAS-mutationen och den andra har NF1-mutationen har vi visat att möss som har mutationer i båda generna utvecklar en mycket aggressiv akut leukemi. Denna strategi har nyligen publicerats i Blood. (2009) 114(17):3629-32.Eftersom en motsvarande ökning i RAS-signalering inte kan förklara det kraftiga förloppet tyder det på att Nf1 spelar en annan roll i sjukdomsutvecklingen än man hittills trott, som troligen delvis inte har med RAS-proteinet att göra. Det tyder på att det finns en mekanism bakom cancerutvecklingen som vi inte känt till tidigare, och det ger möjlighet att utveckla nya behandlingar för patienter som har mutationer i Nf1.
I mitt projekt kan jag undersöka vilken roll Nf1-proteinet har och hur den nya kunskapen kan leda till nya och förbättrade behandlingsstrategier. Man kan därmed identifiera nya strategier för att behandla cancersjukdomar som involverar Nf1-inducering som ger hyperaktiv Ras-signalering, för att avgöra om hämning av specifika CAAX-proteiner kan blockera utvecklingen av letal leukemi.
Preliminära resultat från den pågående studien rörande hyperaktiv Ras-signalering presenterades vid European Hematology Association XIII konferens, och vi beräknar att manuskriptet rörande Nf1inducering och hämning av det specifika CAAX-proteinet Rce1 kan skickas in för vetenskaplig publicering 2014.

Referenser

5. Liu M, Sjögren A-K. Karlsson C., Ibrahim M., Olofsson F.J., Wahlström A.M., Dalin M., Yu H., Andersson K., Yang S.H., Young S.G., Bergo M.O. Targeting the protein Prenyltransferases efficiently reduces tumor development in mice with K-RAS-induced lung cancer. PNAS, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,107(14):6471-6 (2010).
4.Cutts B.A., Sjögren A-K., Andersson K., Wahlström A.M Karlsson C., Swolin B., Bergo M.O. Nf1 deficiency co-operates with oncogenic K-RAS to induce acute myeloid leukemia in mice. Blood 114(1): 3629-3632 (2009)
3. Wahlström A.M., Cutts B, Liu M, Lindskog A, Karlsson C.,Sjögren A-K., Andersson K, Young S.G., Bergo M.O. Inactivating Icmt ameliorates K-RAS-induced myeloproliferative disease. Blood, 112:1357-1365 (2008).
2. Sjögren A-K., Andersson K, Liu M, Cutts B.A., Karlsson C., Wahlström A.M., Dalin M., Weinbaum C., Casey P.J., Tarkowski A., Swolin B., Young S.G., Bergo M.O., GGTase-I deficiency reduces tumor formation and improves survival in mice with K-RAS-induced lung cancer. J Clin. Invest. 117(5): 1294-1304 (2007).
1.Wahlström A.M.,Cutts B.A., Karlsson C., Andersson K., Liu M., Sjögren A-K., Swolin B., Young S.G., Bergo M.O. Rce1 deficiency accelerates the development of K-RAS-induced myeloproliferative disease. Blood 109(2): 763-768 (2007)